發(fā)布時間：2018-05-25 04:02

  本文選題：分泌IL-10B細胞 + 調節(jié)性作用　； 參考：《廣西醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)是由病毒感染所致的一種心肌炎癥性疾病。大部分的VMC可以完全康復,但少部分進展為擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)。目前VMC的發(fā)病機制尚未完全闡明。研究表明T細胞在VMC的發(fā)病環(huán)節(jié)中扮演重要角色,其中Th1細胞在VMC急性期即出現顯著增高并分泌IFN-Y參與心肌炎癥反應,Th17細胞通過分泌IL-17加重心肌損傷和促進纖維化。調節(jié)性B細胞(regulatory B cells,Bregs)是一類新發(fā)現的具有調節(jié)性功能的B細胞。其中最重要的亞型是分泌IL-10B細胞(IL-10-producing B cells)。分泌IL-10B細胞通過IL-10,在細胞水平調節(jié)其他細胞,尤其是效應性T細胞。已有的研究表明,調節(jié)性B細胞在一些免疫炎癥性疾病中具有調節(jié)作用。然而,在VMC中,是否存在分泌IL-10B細胞,作用機制如何,目前尚未見報道。為此,本研究用柯薩奇病毒B3(Coxsackie virus B3,CVB3)建立小鼠VMC模型,深入探索分泌IL-10B細胞在小鼠VMC發(fā)病中的作用及其機制,為VMC的治療尋求新靶點。本研究主要通過以下三部分進行。第一部分分泌IL-10B細胞在小鼠VMC發(fā)病過程中的變化目的:探討分泌IL-10B細胞在VMC發(fā)病過程中的動態(tài)變化,及其與Th1、Th17細胞和心肌病理等指標的關系。方法:4周齡BALB/c小鼠80只,隨機分為VMC組(n=50)和對照組(n=30),兩組BALB/c小鼠均設1、2、4周3個時點亞組。CVB3腹腔注射建立小鼠VMC模型,每個時點亞組小鼠分別為12只、18只、20只。腹腔注射PBS建立對照組,每個時點亞組小鼠均為10只。在相應時間點從兩組各取10只小鼠,用流式細胞術檢測脾臟分泌IL-10B細胞、CD1d~(hi)CD5~+B細胞、Th1細胞及Th17細胞,并且對心肌組織進行HE染色觀察病理變化、計算心肌病理積分。結果:1、VMC組心肌組織HE染色顯示,CVB3感染后1周出現心肌細胞局灶壞死和炎癥細胞的浸潤;第2周亞組心肌細胞壞死病灶增加、炎癥細胞浸潤明顯增多;第4周亞組未見心肌細胞壞死、炎癥細胞浸潤不明顯。對照組各亞組心肌組織病理均正常。2、VMC組心肌病理積分在1、2、4周亞組分別為2.30±0.48、2.90±0.74及1.40±0.52,與對照組各亞組(均為0)相比均顯著增高(P均0.01),并且VMC組第2周亞組明顯高于第1周亞組(P0.05)及第4周亞組(P0.01)。3、VMC組各亞組脾臟分泌IL-10B細胞與對照組各亞組比較,1、2、4周亞組比例均明顯升高(2.70%±0.69%versus 0.90%±0.36%;3.10%±0.50%versus 1.18%±0.31%;1.37%±0.35%versus 0.97%±0.21%。P 均0.01),并且 VMC 組第 1、2 周亞組均明顯高于第4周亞組(P均0.01)。4、VMC組各亞組脾臟Th1細胞與對照組各亞組比較,1、2、4周亞組均顯著增高(6.62%±L 00%versus 3.44%±1.34%;8.28%±2.04%versus 3.52%±1.15%;5.61%±1.14%versus 3.97%±1.01%。P均0.01),并且VMC組第2周亞組明顯高于第1周亞組(P0.05)及第4周亞組(P0.01)。5、VMC組各亞組脾臟Th17細胞與對照組各亞組相比,在1、2、4周亞組均顯著增高(2.46%±0.50%versus 0.98%±0.40%,P0.05;5.35%±1.11%versus 1.12%±0.51%,P0.01;2.49%±0.48%versus 0.98%±0.27%,P0.01),并且 VMC 組第 2 周亞組明顯高于第1及第4周亞組(P均0.01)。6、與對照組各亞組比較,VMC組1、2、4周亞組脾臟CD1d~(hi)CD5~+B細胞均明顯增高(5.32%±1.20%versus 2.10%±0.66%;5.56%±1.03%versus 2.70%±0.63%;4.85%± 1.02%versus 2.85%±0.6%。P均0.01),VMC組各亞組間無明顯差別(P均0.05)。結論:CVB3腹腔注射成功建立小鼠VMC模型;VMC小鼠的脾臟分泌IL-10B細胞在發(fā)病的1、2、4周均明顯增多,并且呈先高后低的變化趨勢,而CD1d~(hi)CD5~+B細胞在發(fā)病過程中持續(xù)增多;VMC小鼠Th1細胞和Th17細胞在發(fā)病的1、2、4周均明顯增多,并且第2周達高峰;伴隨VMC模型的心肌炎發(fā)生、發(fā)展及恢復的病理改變,小鼠的分泌IL-10B細胞、Th1細胞和Th17細胞比例有相應平行動態(tài)改變趨勢。第二部分 分泌IL-10B細胞對VMC小鼠Th1和Th17細胞的調節(jié)作用研究一、目的:探討過繼分泌IL-10B細胞對缺乏T和B細胞小鼠VMC的影響。方法:4周齡雄性BALB/c背景的SCID小鼠40只隨機分成干預組(n=20)和對照組(n=20)。CVB3感染SCID小鼠建立VMC模型。干預組CVB3感染SCID小鼠前1天,尾靜脈注射來源于急性VMC小鼠的分泌IL-10B細胞。對照組注射生理鹽水作為陰性對照。觀察兩組小鼠的生存情況,并在第14天從每組中隨機選取8只小鼠,對心肌組織進行HE染色觀察病理變化、計算心肌病理積分。結果:1、干預組心肌病理積分與對照組比較無明顯差別(3.28±0.28 versus 3.47±0.24,P0.05)。2、兩組的中位生存時間無差異(8.70d±0.57d versus 7.93d±0.65d,P0.05)。結論:過繼分泌 IL-10B細胞不能減輕缺T和B細胞的急性VMC小鼠的心肌組織的病理改變,也不能延長VMC小鼠的生存時間,提示分泌IL-10B細胞在小鼠VMC發(fā)病中通過T細胞而起作用。研究二、目的:探討過繼分泌IL-10B細胞對缺B細胞小鼠VMC的影響。方法:SCID 小鼠 60 只隨機分成 3 組:na(?)ve 組(n=20)、sensitized 組(n=20)和contro1組(n=20)。尾靜脈注射CD4~+T細胞同時腹腔注射CVB3建立一個缺乏B細胞的小鼠VMC模型。在VMC模型建立前1天,分別尾靜脈注射來源正常 BALB/c 小鼠(na(?)ve 組)、急性 VMC BALB/c 小鼠(sensitized 組)的分泌IL-10B細胞,contro1組注射生理鹽水作為陰性對照。觀察3組小鼠14天的生存情況,并在第14天從各組中隨機選取10只小鼠,HE染色觀察病理變化、計算心肌病理積分,RT-PCR檢測Th1轉錄因子T-bet和Th17轉錄因子ROR γ t的mRNA表達量,流式細胞術檢測脾臟Th1和Th17細胞的比例。結果:1、與對照組比較,naive組的心肌病理積分無變化(2.12±1.07 versus 2.87±0.85,P0.05),而 sensitized 組心肌病理積分顯著減低(1.21±0.60 versus 2.87±0.85,P0.01)。2、與對照組比較,na(?)ve組的中位生存時間無顯著差異(12.50d±0.70d versus 11.05d±0.68d,P0.05),而sensitized組中位生存時間明顯延長(13.4d±0.24d versus 11.05d±0.68d,P0.05)。3、與對照組比較,na(?)ve組的VMC小鼠中脾臟Th1 和 Th17 細胞的比例無變化(4.10%± 1.74%versus5.83%±2.02%;2.24%±1.34%versus 2.92%± 1.32%。P 均0.05),而 sensitized 組 VMC 小鼠脾臟Th1和Th17細胞的比例均顯著降低(3.20%±2.31%versus5.83%±2.02%,P0.01;1.35%±1.24%versus2.92%±1.32%,P0.05)。4、與對照組比較,naive組心肌T-bet mRNA和ROR γ t的mRNA表達量均無明顯變化(3.76±1.49 versus4.62±2.60;155±0.90 versus2.67±1.92.P均0.05),而sensitized組心肌T-bet和ROR γ t的mRNA表達量均明顯降低(1.31±1.28 versus 4.62±2.60,P0.01;1.30±0.35 versus 2.67±1.92,P0.05)。結論:免疫性過繼來源于急性VMC小鼠的分泌IL-10B細胞可減輕缺B細胞小鼠的心肌炎病理改變、延長生存時間,其機制主要通過下調T-bet和ROR γ t的mRNA轉錄而降低Th1細胞和Th17細胞比例;過繼來源于正常小鼠的分泌IL-10B細胞不能調節(jié)缺B細胞VMC小鼠的T-bet和ROR Y t的mRNA轉錄以及Th1細胞和Th17細胞的比例,因而缺B細胞VMC小鼠的心肌炎病理表現及生存時間也沒有受到影響。提示分泌IL-10B細胞通過下調T-bet和ROR γ t的mRNA轉錄而降低Th1細胞和Th17細胞比例,從而抑制VMC小鼠心肌的炎癥損傷。第三部分過繼分泌IL-10B細胞對小鼠VMC發(fā)病過程的影響目的:探討不同時點過繼分泌IL-10B細胞對VMC小鼠心肌損傷及預后的影響。方法:4周齡BALB/c小鼠40只隨機分成干預組(n=20)和對照組(n=20)。CVB3感染BALB/c小鼠建立VMC模型。干預組分別于CVB3感染前1天,VMC第3天或第7天尾靜脈注射來源于急性VMC小鼠的分泌IL-10B細胞。對照組尾靜脈注射生理鹽水。觀察兩組小鼠14天的生存情況并在第14天從每組中隨機選取10只小鼠,HE染色觀察病理變化、計算心肌病理積分,流式細胞術檢測脾臟Th1和Th17細胞的比例。結果:1、與對照組比較,VMC模型建立前過繼分泌IL-10B細胞的干預組VMC小鼠的中位生存時間明顯延長(13.80d±0.11d versus 11.80d±0.62d,P0.05),心肌病理積分明顯低于對照組(2.08±0.54 versus 2.98±0.55,P0.01),脾臟Th1和Th17細胞的比例均顯著降低(4.57%±2.04%versus8.71%±2.29%;3.58%±0.57%versus5.36%± 1.08%。P 均0.01)。2、與對照組比較,VMC第3天過繼分泌IL-10B細胞的干預組不能延長VMC小鼠中位生存時間(12.95d±0.37dversus 11.75d±0.64d,P0.05),但心肌病理積分明顯減低(2.08±0.54 versus 2.94±0.30,P0.01),脾臟Th1 和 Th17 細胞的比例均顯著降低(5.23%±1.94%versus8.17%±2.21%;3.35%±0.62%versus5.14%±1.20%,P 均0.01)。3、與對照組比較,VMC第7天過繼分泌IL-10B細胞的干預組VMC小鼠的中位生存時間無顯著差異(12.55d±0.49d versus 12.20d±0.57d,P0.05),心肌病理積分無變化(2.47±0.66 versus3.01±0.56,P0.05),脾臟 Th1 和 Th17 細胞的比例亦無顯著差異(4.60%± 1.97%versus 6.27%± 2.02%;4.03%± 0.60%versus4.87%±1.18%。P 均0.05)。結論:在CVB3建立小鼠VMC前過繼分泌IL-10B細胞可下調Th1和Th17細胞比例,從而減輕心肌炎癥損傷、延長VMC小鼠的生存時間;VMC小鼠在發(fā)病的第3天過繼分泌IL-10B細胞可下調Th1和Th17細胞比例從而減輕心肌炎癥損傷,但不能延長生存時間;VMC小鼠在發(fā)病第7天過繼分泌IL-10B細胞不能下調Th1和Th17細胞比例,也不能改變心肌炎癥損傷及VMC小鼠生存時間。本研究結果提示:1、VMC小鼠的分泌IL-10B細胞在發(fā)病的1、2、4周均明顯增多,并且呈先高后低的變化趨勢;伴隨VMC模型的心肌炎發(fā)生、發(fā)展及恢復的病理改變,小鼠的分泌IL-10B細胞、Th1細胞和Th17細胞比例有相應平行動態(tài)改變趨勢。2、分泌IL-10B細胞在小鼠VMC發(fā)病中通過T細胞而起作用,并且主要通過下調T-bet和ROR γ t的mRNA轉錄而降低Th1細胞和Th17細胞比例,從而抑制VMC小鼠心肌的炎癥損傷。3、在發(fā)病前或發(fā)病早期過繼分泌IL-10B細胞,可下調Th1和Th17細胞比例,從而減輕VMC小鼠的心肌炎癥損傷。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R542.21

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1 韋斌;分泌IL-10B細胞在小鼠病毒性心肌炎發(fā)病中的作用及其機制[D];廣西醫(yī)科大學;2017年

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本文編號：1931976