本文選題：細(xì)胞色素上皮源性因子 + CD36�。� 參考：《山東大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景動(dòng)脈粥樣硬化(artherosclerosis,AS)是臨床患者發(fā)生心血管疾病的重要病理學(xué)基礎(chǔ),患有AS的患者有較大可能發(fā)生心肌梗死、主動(dòng)脈狹窄、腦出血、外周動(dòng)脈疾病等,嚴(yán)重威脅著人們的身體健康。AS的發(fā)病機(jī)制主要包括血管內(nèi)皮損傷、血脂沉積、炎癥等,血管內(nèi)皮損傷會(huì)增加內(nèi)皮對(duì)脂蛋白及其他血漿成分的通透性;內(nèi)皮調(diào)節(jié)功能紊亂失調(diào),內(nèi)皮素的釋放增加,一氧化氮(NO)的合成與分泌量減少;內(nèi)皮粘附分子如細(xì)胞粘附分子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)、E-選擇素、P-選擇素表達(dá)量增加;從而降低了內(nèi)皮的抗栓功能。AS的發(fā)生也是一種慢性炎癥性疾病,臨床的發(fā)生以血管平滑肌細(xì)胞增生與血脂沉積后形成粥樣斑塊為發(fā)病特點(diǎn),發(fā)病時(shí)常可見動(dòng)脈管腔壁上存在小米粥樣的脂類物質(zhì)沉積,會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈管腔的狹窄與動(dòng)脈血管壁的彈性降低。有臨床研究表明,AS是造成冠心病發(fā)生的最重要的病因,我國每年因冠心病致死的患者人數(shù)居世界第二位,而我國因AS致死患者總量在所有致死性疾病中位于首位,根據(jù)流行病學(xué)及對(duì)國內(nèi)患者死因統(tǒng)計(jì)的結(jié)果,在未來十年,我國因冠心病造成的死亡率仍將會(huì)呈不斷上升的趨勢。因此如何早期發(fā)現(xiàn)AS的病變并有效抑制AS的發(fā)生發(fā)展,是臨床的熱點(diǎn)話題。AS的形成是以巨噬細(xì)胞不斷吞噬脂蛋白形成泡沫細(xì)胞為起始階段。在整個(gè)AS的進(jìn)程中都始終伴隨著巨噬細(xì)胞的吞噬和巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞吞噬脂蛋白是由受體介導(dǎo)的,CD36是其中最為關(guān)鍵的受體之一。CD36是一種B類清道夫受體,在人體的單核-巨噬細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血小板等多種細(xì)胞表面高度表達(dá)。CD36的基因定位在7號(hào)常染色體的q11.2,在人體內(nèi)可以促進(jìn)特異性脂質(zhì)分子如氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)、長鏈脂肪酸(Long Chain Fatty Acid,LFA)等多種分子的攝取,另外也可以與生物大分子相結(jié)合,通過傳導(dǎo)細(xì)胞信號(hào),引發(fā)相關(guān)的炎癥、噬菌以及凋亡等細(xì)胞過程的發(fā)生。色素上皮源性因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)是絲氨酸蛋白酶抑制因子的一類,但并不具備抑制蛋白酶的功能,位于染色體短臂17p13.1區(qū),其基因共有八個(gè)外顯子及七個(gè)內(nèi)含子組成,三維空間結(jié)構(gòu)的電荷分布具有明顯的不對(duì)稱性。PEDF是一種多功能蛋白,具有營養(yǎng)、保護(hù)神經(jīng)、抗腫瘤、抗血管生成、抗血管通透性作用,還可以抑制炎癥反應(yīng)與血栓的形成。PEDF可以抑制血小板表面的粘附因子-P選擇蛋白的表達(dá),因此可以抑制血小板的激活及凝集,阻斷NADPH氧化酶與膠原蛋白誘導(dǎo)的ROS生成,達(dá)到抗血栓形成、保護(hù)血管的目的。近期研究發(fā)現(xiàn)PEDF具有抑制巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng),對(duì)AS的穩(wěn)定性有保護(hù)作用,發(fā)揮抗AS的作用。CD36是介導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)的關(guān)鍵受體,CD36受體的表達(dá)增加可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬作用,進(jìn)而促進(jìn)AS進(jìn)展,我們推測,PEDF可能通過抑制CD36的表達(dá),抑制巨噬細(xì)胞吞噬作用,進(jìn)而發(fā)揮抗AS作用。研究目的1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)揭示PEDF過表達(dá)對(duì)apoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)CD36的表達(dá)的影響。2.體外實(shí)驗(yàn)揭示PEDF對(duì)巨噬細(xì)胞清道夫受體CD36的表達(dá)的影響。研究方法本研究使用SPF級(jí)8周齡apoE-/-雄性小鼠20只作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象,將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行1周的適應(yīng)性飼養(yǎng),根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將全部小鼠分為對(duì)照組與PEDF組,每組小鼠各10只。使用高脂喂養(yǎng)方法(高脂飼料配方:小鼠基礎(chǔ)飼料94.3%,豬油3%,膽固醇2%,膽酸鈉0.5%,丙基硫氧嘧啶0.2%,將高脂飼料按照配方的比例搭配好后,將飼料進(jìn)行烘干后仔細(xì)保存,用于實(shí)驗(yàn)小鼠的喂養(yǎng)。)喂養(yǎng)16周后,給予PEDF組小鼠尾靜脈注射含有PEDF的慢病毒,注射劑量為1×108TU/只,對(duì)照組小鼠給予同等量的尾靜脈陰性病毒注射,4周后將兩組小鼠處死后,將小鼠主動(dòng)脈根部組織進(jìn)行取材后迅速置于4%多聚甲醛溶液中,使用常規(guī)石蠟包埋與切片處理。將RAW264.7細(xì)胞種植于6孔板,使用高糖DMEM(10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素)將細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24h后分成四組,分別為ox-LDL組、ox-LDL+陰性病毒轉(zhuǎn)染(G)組、ox-LDL+PEDF組、Con組。待細(xì)胞貼壁8h后,將腺病毒包圍的PEDF以MIC值為30轉(zhuǎn)染進(jìn)ox-LDL+PEDF組細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染后24h觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染的情況。分別給予 ox-LDL 組、ox-LDL+G 組、ox-LDL+PEDF 組的細(xì)胞群 ox-LDL80 μ g/ml,不給予Con組。。CD36蛋白表達(dá)的檢測使用免疫組化染色法,并按照SP-9001免疫組化試劑盒的說明書的步驟進(jìn)行操作。免疫組化的一抗為兔抗鼠CD36多克隆抗體,按照1:100的比例進(jìn)行稀釋;陰性對(duì)照一抗為PBS。使用新鮮配置好的DAB溶液進(jìn)行顯色,顯色時(shí)間3-5min后使用自來水進(jìn)行充分的沖洗,再次使用蘇木素進(jìn)行復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片。將每例小鼠的標(biāo)本放置于顯微鏡400倍的視野下進(jìn)行選擇,選取每張切片中主動(dòng)脈組織分布及染色均勻的4個(gè)視野,應(yīng)用Image pro-Plus 6.0圖文分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析。將呈現(xiàn)棕色反應(yīng)顆粒的細(xì)胞判定為陽性,CD36蛋白的陽性表達(dá)水平以視野下陽性表達(dá)面積與總面積的比值進(jìn)行計(jì)算。RAW264.7細(xì)胞的CD36蛋白表達(dá)使用免疫印跡法進(jìn)行檢測。將各組RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行收集后將各組細(xì)胞中總蛋白進(jìn)行提取,使用Bradford法測定蛋白濃度,放置于-40℃的環(huán)境下保存。將蛋白提取液使用10%的SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、封閉,一抗CD36以1:1000的比例在恒溫4℃下孵育過夜,二抗孵育2h,ECL發(fā)光孵育5min后將蛋白置于Image pro-Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)下進(jìn)行圖像掃描,目的蛋白的灰度值與內(nèi)參蛋白的灰度值比值作為相對(duì)蛋白表達(dá)水平。收集各組RAW264.7細(xì)胞,按照試劑盒的說明書將各組細(xì)胞的RNA提取后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入PCR反應(yīng)體系中,使用離心機(jī)瞬時(shí)離心后放置于PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的條件為30-35循環(huán),95℃下預(yù)變性180s,變性30s,56℃下退火30s,72℃延伸50s,72℃延伸10min。將陽性標(biāo)準(zhǔn)品與PCR產(chǎn)物各10uL與2.5%的瓊脂糖凝膠電泳20min,對(duì)結(jié)果觀察并記錄分析。使用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以(x±s)的表達(dá)方式進(jìn)行描述,組間比較使用T檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)比較以P0.05表示有意義。研究結(jié)果1.小鼠斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞表面CD36蛋白表達(dá)對(duì)兩組小鼠主動(dòng)脈根部組織處AS斑塊處巨噬細(xì)胞表面的CD36蛋白表達(dá)情況進(jìn)行測定,免疫組化結(jié)果見圖1。PEDF組小鼠的CD36表達(dá)為(29.00±0.58)%,對(duì)照組小鼠的CD36表達(dá)為(14.00±1.16)%,兩組小鼠的CD36表達(dá)情況比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與對(duì)照組比較,PEDF組小鼠主動(dòng)脈根部處巨噬細(xì)胞表面的CD36蛋白表達(dá)明顯較低。2.RAW264.7細(xì)胞CD36蛋白表達(dá)使用免疫印跡法對(duì)四組RAW264.7細(xì)胞中CD36的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測,結(jié)果見圖 2。其中 ox-LDL 組為(0.75±0.06),ox-LDL+G 組為(0.83±0.07),ox-LDL+PEDF 組為(0.55±0.00),Con 組為(0.34±0.03)。將 Con 組作為對(duì)照組,ox-LDL組與ox-LDL+G組細(xì)胞中的CD36蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組,有顯著性差異(P0.05),ox-LDL+PEDF組細(xì)胞的CD36蛋白表達(dá)水平則明顯低于ox-LDL組與ox-LDL+G組,有顯著性差異(P0.05)。3.RAW264.7細(xì)胞CD36 mRNA水平表達(dá)使用RT-PCR對(duì)四組RAW264.7細(xì)胞的CD36 mRNA表達(dá)情況進(jìn)行檢測,結(jié)果見圖 3,其中 ox-LDL 組為(6.93±0.14),ox-LDL+G 組為(8.34±0.16),ox-LDL+PEDF組為(1.81±0.23),Con組為(1.01±0.03)。Con組為對(duì)照組別,與其相比,ox-LDL 組與 ox-LDL+G 組的 CD36 表達(dá)情況顯著增加(P0.05),ox-LDL+PEDF組與ox-LDL組及ox-LDL+G組比較,CD36表達(dá)情況顯著降低(P0.05)。研究結(jié)論1.PEDF具有抑制巨噬細(xì)胞表面CD36表達(dá)的作用。2.ApoE-/-小鼠轉(zhuǎn)染PEDF病毒載體后,AS斑塊內(nèi)CD36的表達(dá)明顯降低。
[Abstract]:The pathogenesis of AS is one of the most important causes of coronary heart disease . The pathogenesis of AS is the most important cause of coronary heart disease . The effects of PEDF on the expression of CD36 in apoE - / - mouse atherosclerotic plaques were studied . After 16 weeks of feeding , the PEDF group mice were given the slow virus containing PEDF , the amount of injection was 1 脳 108 TU / , and the control group mice were injected with the same amount of tail vein negative virus . After 4 weeks , the cells were cultured in 4 % polyformaldehyde solution . The cells were cultured for 24 h . The cells were transfected into ox - LDL + PEDF group . The ox - LDL + PEDF group was transfected into the ox - LDL + PEDF group . The expression of CD36 protein was detected by immunohistochemical staining . The expression level of CD36 protein in each group was analyzed by the method of Western blotting . The expression of CD36 protein in each group was determined as positive . The expression level of CD36 protein was determined as positive . The expression level of CD36 protein was analyzed by using Western blotting . The results showed that the expression of CD36 protein in each group was incubated at 4 鈩，

本文編號(hào)：1927976