本文選題：免疫性血小板減少癥 + 巨噬細(xì)胞吞噬作用　； 參考：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：原發(fā)免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia,ITP),既往稱為特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP),是臨床上最常見的免疫性出血性疾病,以外周血中血小板數(shù)目減少為特點,患者體內(nèi)血小板板數(shù)減少會增加出血的風(fēng)險,輕者可無出血癥狀,嚴(yán)重者可出現(xiàn)月經(jīng)過多、皮膚粘膜出血,甚至內(nèi)臟或顱內(nèi)出血(1-5%患者)危及生命。ITP的發(fā)病機制復(fù)雜,主要為血小板自身抗體介導(dǎo)的血小板破壞增多。患者自身免疫失耐受,產(chǎn)生了針對血小板表面糖蛋白(glycoprotein,GP)主要為針對GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/IX的自身抗體,此外也有少部分針對GPIa/Ⅱa、GPIV、GPV及GPVI的抗體,以上自身抗體與血小板表面糖蛋白抗原表位結(jié)合后,抗體的Fc段與網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中組織性巨噬細(xì)胞的FcγRⅡa及FcγRⅢa結(jié)合,介導(dǎo)抗體包被的血小板在脾臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中被單核巨噬細(xì)胞識別、吞噬并破壞,使患者外周血小板生存期縮短,數(shù)量減少,導(dǎo)致出血癥狀。其次細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的血小板破壞和巨核細(xì)胞的凋亡異常及成熟障礙導(dǎo)致的血小板生成不足也在部分ITP患者發(fā)病中起重要作用。吞噬作用是先天性和獲得性免疫中的重要組成部分,在抵抗致病菌入侵的第一道防線中起到重要作用,并在維持和調(diào)節(jié)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中也發(fā)揮作用。吞噬作用失調(diào)不僅僅會導(dǎo)致宿主細(xì)胞對致病菌的免疫異常,而且會導(dǎo)致免疫耐受失調(diào)從而產(chǎn)生慢性炎癥和自身免疫性疾病。吞噬過程可被多種細(xì)胞表面受體誘發(fā),其中主要有以下兩類:其一為非調(diào)理素受體,此類受體可以直接識別并與目標(biāo)分子結(jié)合;其二為調(diào)理素受體,調(diào)理素受體可以識別調(diào)理素分子如抗體、補體。在調(diào)理素受體中,Fcγ受體是研究的熱點,它可以與IgG的Fc部分結(jié)合,也可通過結(jié)合補體C3bi部分與補體受體3(CR3)相識別。目前推薦的ITP一線治療方法包括免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)劑(例如:腎上腺皮質(zhì)激素治療、靜脈丙種球蛋白治療(IVIg)和抗-Rh(D)免疫球蛋白治療)。以上三種制劑都可以競爭性結(jié)合單核巨噬細(xì)胞上的Fc受體,阻礙了單核巨噬細(xì)胞與抗體包被的血小板的結(jié)合,防止血小板滯留于脾內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng),減少單核巨噬細(xì)胞對血小板的吞噬,并抑制單核巨噬細(xì)胞的趨化作用和遲發(fā)超敏反應(yīng),改善毛細(xì)血管通透性,緩解出血癥狀。但是上治療可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用,如糖皮質(zhì)激素可導(dǎo)致皮質(zhì)功能亢進(jìn)綜合征、骨質(zhì)疏松等副作用。靜脈丙種球蛋白治療雖具有IgG含量高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點,患者注射后可使體內(nèi)的IgG水平迅速升高,用藥24h后即可觀察到血小板計數(shù)上升,約1周左右達(dá)峰值。但患者的治療反應(yīng)是暫時的,血小板計數(shù)難以長期維持,在治療3-4周后血小板計數(shù)即降至治療前水平,極少數(shù)病例可表現(xiàn)為持續(xù)反應(yīng),導(dǎo)致患者需定期接種、治療費用昂貴。對于以上治療效果欠佳的患者,二線治療措施首選脾切除。本病易反復(fù)發(fā)作、病程長,部分患者對現(xiàn)有一線、二線治療無效或在短期內(nèi)復(fù)發(fā),反復(fù)治療遷延不愈發(fā)展為難治性ITP,顯著降低了患者的生存質(zhì)量。CD44分子是一種分布廣泛的細(xì)胞表面黏附分子,可表達(dá)在白細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞和一些內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。CD44分子可識別透明質(zhì)酸(HA)和骨橋蛋白,是細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與ECM相互識別和作用的分子基礎(chǔ)。之前的研究已經(jīng)證實,CD44分子的激活可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。例如,帶有透明質(zhì)酸片段的CD44分子可以誘導(dǎo)多種炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,體外試驗也證明CD44分子同時還可以直接調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的遷移,此外CD44分子與透明質(zhì)酸分子的相互作用還可以調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的粘附。CD44分子抗體已成功應(yīng)用于多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病的動物模型,包括實驗性自身免疫性腦脊髓炎、膠原或抗體誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、自身免疫性糖尿病、實驗性自身免疫性葡萄膜炎、實驗性潰瘍性結(jié)腸炎、實驗性肺嗜酸性粒細(xì)胞增多癥和皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)等,但其具體作用機制仍不十分清楚。IM7是一種鼠抗人CD44單克隆抗體,可識別CD44分子胞外部分,已廣泛應(yīng)用于許多研究,其強大的抗炎作用已經(jīng)在多種疾病模型中被證實。此外,CD44單克隆抗體KM81,KM201和KM114也被證明在關(guān)節(jié)炎中具有部分抗炎作用。我們之前的研究還發(fā)現(xiàn)CD44單克隆抗體KM114可以明顯改善ITP小鼠模型中SCID小鼠的血小板減少癥狀,對照組SCID小鼠接受腹腔注射血小板抗體處理后血小板數(shù)量明顯下降,實驗組接受CD44分子抗體KM114和靜脈注射丙種球蛋白(IVIg)預(yù)處理的SCID小鼠體內(nèi)血小板的破壞程度顯著下降,這表明CD44抗體可以在被動ITP小鼠模型中與靜脈注射丙種球蛋白(IVIg)起到相似的治療作用,且這種作用不依賴于與B或T細(xì)胞的相互作用。以上研究結(jié)果為ITP的治療提供了新的方向。此外,丙種球蛋白來自于血漿產(chǎn)品,制作成本高、產(chǎn)量有限,臨床使用費用昂貴,然而CD44單克隆抗體相比而言,可以節(jié)省成本,也可為患者減少治療費用,有重要的研究價值及前景。在本項研究中,我們利用流式細(xì)胞儀及共聚焦顯微鏡等方法檢測CD44單克隆抗體預(yù)處理對巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響,證據(jù)表明,抗CD44單抗IM7、KM114都可以抑制巨噬細(xì)胞FcyR介導(dǎo)的血小板吞噬作用,且相同濃度的IM7相較于KM114而言,對巨噬細(xì)胞吞噬作用有更強的抑制作用。此外,數(shù)據(jù)表明CD44分子抗體不影響血小板與巨噬細(xì)胞的結(jié)合,我們推測CD44單抗作用于結(jié)合后的巨噬細(xì)胞內(nèi)吞過程。然而對于巨噬細(xì)胞Fc γ R介導(dǎo)的紅細(xì)胞吞噬作用僅IM7可以起到抑制作用。目的:CD44單克隆抗體的廣泛抗炎特性,以及之前研究結(jié)果表明KM114等CD44單克隆抗體可以在ITP小鼠模型中起到治療作用促使我們想要探究它是否能抑制巨噬細(xì)胞的吞噬功能。利用抗體包被/未包被的紅細(xì)胞/血小板與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng),檢測巨噬細(xì)胞的吞噬作用,在體外模擬ITP的主要發(fā)病機制;將經(jīng)過CD44抗體預(yù)處理的巨噬細(xì)胞與抗體包被的紅細(xì)胞/血小板共培養(yǎng),檢測不同表型及不同濃度的CD44單克隆抗體對巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響,并分析其與抗體表型及濃度的關(guān)系;檢測不同表型及不同濃度的CD44單克隆抗體與巨噬細(xì)胞表面CD44分子的結(jié)合能力,明確CD44單克隆抗體作用產(chǎn)生的具體機制。方法:1.培養(yǎng)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞、THP-1人白血病單核細(xì)胞系。2.用PMA刺激THP-1細(xì)胞過夜,使之進(jìn)一步分化為巨噬細(xì)胞。3.收取CD1野生型雌性小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞,培養(yǎng)得原代小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。4.收取CD1野生型雌性小鼠的外周血,Coulter counter計數(shù)血小板數(shù)目、Grava流式細(xì)胞儀計數(shù)紅細(xì)胞數(shù)目,離心獲取紅細(xì)胞及血小板。5.用Ter-119及Mwreg30等抗體包被紅細(xì)胞/血小板,將抗體包被的紅細(xì)胞/血小板與小鼠巨噬細(xì)胞在37℃共培養(yǎng)30分鐘。6.倒置顯微鏡檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)吞的紅細(xì)胞數(shù)目,在顯微鏡下隨機計數(shù)200-300個巨噬細(xì)胞,計算巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)(PI),即PI=被內(nèi)吞的所有紅細(xì)胞數(shù)/巨噬細(xì)胞總數(shù)×100。7.流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)血小板的含量,即以CMFDA標(biāo)記血小板,以CMFDA的平均熒光強度來反應(yīng)巨噬細(xì)胞對抗體包被的血小板的吞噬指數(shù)。8.巨噬細(xì)胞吞噬試驗檢測CD44分子抗體對巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響。即以CD44單克隆抗體KM114/IM7預(yù)處理巨噬細(xì)胞,并將抗體包被的紅細(xì)胞/血小板與小鼠巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)30分鐘。9.熒光共聚焦顯微鏡檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對抗體包被的山羊紅細(xì)胞的吞噬指數(shù),即預(yù)先以CMFDA標(biāo)記紅細(xì)胞,待與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后,以Alexa Fluor-643標(biāo)記的兔抗羊二抗標(biāo)記巨噬細(xì)胞外的紅細(xì)胞,以Alexa Fluor-555標(biāo)記的麥芽胚凝集素染色巨噬細(xì)胞膜,在顯微鏡下分別計數(shù)200-300個巨噬細(xì)胞內(nèi)的紅細(xì)胞,計算巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)(PI=巨噬細(xì)胞內(nèi)吞的紅細(xì)胞數(shù)/巨噬細(xì)胞總數(shù)× 100)。10.熒光共聚焦顯微鏡檢測巨噬細(xì)胞對血小板的吞噬指數(shù)及結(jié)合指數(shù),即預(yù)先以CMFDA標(biāo)記血小板,待與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后,以Alexa Fluor-647標(biāo)記的羊抗鼠二抗標(biāo)記巨噬細(xì)胞外的血小板,在顯微鏡下分別計數(shù)200-300個巨噬細(xì)胞內(nèi)/外的血小板,計算巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)(PI=巨噬細(xì)胞內(nèi)吞的血小板數(shù)/巨噬細(xì)胞總數(shù)×100)。同時計算血小板與巨噬細(xì)胞的結(jié)合指數(shù)(BI=結(jié)合在巨噬細(xì)胞表面的血小板數(shù)/巨噬細(xì)胞總數(shù)× 100)。11.CD44分子抗體結(jié)合實驗,檢測CD44分子抗體與巨噬細(xì)胞的結(jié)合能力。即以CD44單克隆抗體KM114/IM7預(yù)處理巨噬細(xì)胞,以PE標(biāo)記的羊抗鼠二抗標(biāo)記巨噬細(xì)胞表面結(jié)合的CD44分子抗體,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測,以PE的平均熒光強度來反映CD44分子抗體與巨噬細(xì)胞的結(jié)合能力。結(jié)果:1.抗體包被后的紅細(xì)胞/血小板可以被巨噬細(xì)胞識別并吞噬。用抗體TER-119包被的小鼠外周血紅細(xì)胞的吞噬指數(shù)(RAW264.7細(xì)胞PI=157.2;THP-1細(xì)胞 PI=89.63),明顯高于未處理組 P0.0001(RAW264.7 細(xì)胞 PI=0;THP-1細(xì)胞PI=0.49),并且流式細(xì)胞儀檢測得與Mwreg30抗體包被的血小板共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的平均熒光強度明顯高于未處理組(1849 vs 458,P0.001)。2.檢測IM7/KM114預(yù)處理后巨噬細(xì)胞對TER-119包被的小鼠紅細(xì)胞的吞噬作用。結(jié)果表明,在RAW264.7及THP-1分化的巨噬細(xì)胞中,對照組(PI=157.2、89.63),IM70.1ug/ml時吞噬指數(shù)(PI)分別為 157.2、30.49;1 μg/ml、10μg/m丨時PI為0,與對照組有明顯差異(P0.0002),并且這種抑制作用表現(xiàn)為劑量依賴性。然而KM114預(yù)處理對兩種巨噬細(xì)胞對小鼠紅細(xì)胞的吞噬功能沒有影響(KM114 10μg/ml 時 PI=139.47、64.2,P0.55)。3.CD44分子抗體可以抑制巨噬細(xì)胞對血小板的吞噬作用,當(dāng)IM7濃度為0.1μg/ml時,對巨噬細(xì)胞的吞噬作用表現(xiàn)為部分抑制作用(P0.001);當(dāng)IM7濃度為1 μg/ml時即可達(dá)到幾乎完全抑制作用(P0.0001)。當(dāng)KM114濃度為0.1 μg/ml時,可起到輕微抑制作用(P0.001);當(dāng)KM114濃度為1 μg/ml、10μg/ml時,表現(xiàn)為對吞噬作用部分抑制作用(P0.0001)。相同濃度的IM7的抑制作用強于 KM114(P0.02)。KM114 10μg/ml 時與 IM7 1μg/ml 表現(xiàn)為相同程度的抑制能力(P=0.71)。4.CD44分子抗體不影響巨噬細(xì)胞與血小板的結(jié)合。兩種同型對照及低濃度CD44單抗處理后,血小板結(jié)合指數(shù)與對照組相比均無明顯差異(P0.5)。僅在IM7高濃度時(1μg/ml、10μg/ml)表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞表面結(jié)合的血小板增多。5.CD44分子抗體IM7與巨噬細(xì)胞的結(jié)合率大于KM114。RAW264.7巨噬細(xì)胞中,IM7在濃度為5 u g/ml即可達(dá)到90%結(jié)合率;同濃度的IM7與KM114相比,IM7與巨噬細(xì)胞的結(jié)合率明顯高于KM114(P0.001)。其中KM114 10μg/ml與IM7 1 μg/ml表現(xiàn)為相似的與巨噬細(xì)胞的結(jié)合率(P0.5)。KM114在濃度為0.1 μ g/ml、0.5 μ g/ml、1 μ g/ml時與同型對照無顯著性差異(P0.5),在濃度為5 μ g/ml時,結(jié)合率為95.4%明顯高于未處理組(P0.008)。THP-1細(xì)胞中,IM7可以與THP-1細(xì)胞表面的CD44分子結(jié)合,當(dāng)IM7濃度為0.1μ g/ml時與對照組無顯著性差異(P=0.36),在濃度為10 μ g/ml即可達(dá)到90%結(jié)合率(P0.0002)。然而在所有KM114處理組中均與未處理組無明顯差異(P0.5),表明KM114分子無法與THP-1細(xì)胞表面的CD44分子結(jié)合。結(jié)論:1.抗體包被后的紅細(xì)胞/血小板可以被巨噬細(xì)胞識別并吞噬,可以在體外模擬ITP的發(fā)病機制。2.IM7預(yù)處理可以抑制抗體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞對紅細(xì)胞的吞噬作用,并且這種抑制作用表現(xiàn)為劑量依賴性。然而KM114預(yù)處理對巨噬細(xì)胞對小鼠紅細(xì)胞的吞噬功能沒有影響。3.IM7和KM114對抗體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞對血小板的吞噬作用均有抑制作用,并呈現(xiàn)出劑量依賴性,且相同濃度的KM114與IM7相比抑制作用稍弱。說明CD44單克隆抗體可以作為治療ITP的新手段。4.CD44分子抗體不影響血小板與巨噬細(xì)胞的結(jié)合,推測CD44單抗作用于結(jié)合后的巨噬細(xì)胞內(nèi)吞過程。5.CD44分子抗體IM7與巨噬細(xì)胞的結(jié)合率大于KM114,可能是導(dǎo)致IM7對吞噬作用抑制作用較強的原因。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R558.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 Boon King Teh;Yen Seah Tan;Min Chern Lai;Kenneth B.M.Reid;;The Classical and Regulatory Functions of C1q in Immunity and Autoimmunity[J];Cellular & Molecular Immunology;2008年01期

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本文編號：1918817