本文選題：心肌干細胞 + 細胞培養(yǎng)��； 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：目的:心肌干細胞再生療法是心肌梗死的新型治療方法,但是心肌干細胞數(shù)量少,擴增難度大,其體外培養(yǎng)方法并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),國內(nèi)許多實驗室獲得的心肌干細胞未能實現(xiàn)其多向分化潛能的鑒定,從而尚不能作為心肌干細胞的有力佐證。本研究旨在探討一種高效、穩(wěn)定的小型豬心肌干細胞體外培養(yǎng)方法,并且對其進行全面系統(tǒng)的鑒定,為心肌梗死的細胞生物療法奠定基礎(chǔ)。方法:選取成年巴馬小型豬,雌性,體重25-30kg。通過心臟外科手術(shù)經(jīng)右側(cè)第二肋間做小切口鉗取右心耳組織,用組織塊培養(yǎng)法獲取原代心肌干細胞,以心肌干細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng),視細胞生長情況進行傳代。選取分選純化后的第3代細胞行流式檢測鑒定細胞表型:c-kit、CD34、CD45、CD31、CD90、Lineage;行Western Blot檢測心肌早期特異性轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和GATA-4的表達;經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后行免疫熒光檢測CX43、cTnT、α-SMA、vWF的表達以觀察心肌干細胞的多向分化潛能。結(jié)果:1.從成年小型豬右心耳組織中分離的原代細胞于倒置顯微鏡下觀察呈“小、圓、亮”的特征,生長緩慢,傳代后細胞貼壁生長,形態(tài)逐漸變成梭形,較原代易于生長。2.純化后細胞經(jīng)流式細胞儀鑒定細胞表型為c-kit+CD34-CD45-CD31-CD90-Lineage-。3.Western Blot檢測結(jié)果示心肌早期特異性轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和GATA-4表達陽性。4.純化后細胞經(jīng)不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)培養(yǎng)后,能夠表達:心肌細胞特異性蛋白CX43和cTnT,平滑肌細胞特異性蛋白α-SMA,以及內(nèi)皮細胞特異性蛋白v WF。結(jié)論:1.自成年小型豬右心耳組織成功分離獲得細胞表型為c-kit+CD34-CD45-CD31-CD90-Lineage-的細胞,陽性表達干細胞表面標(biāo)記物。2.本研究獲得的細胞能夠表達心肌早期特異性轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和GATA-4,提示該細胞具備調(diào)控自身向心肌細胞早期分化的能力。3.經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)培養(yǎng)后細胞能夠表達CX43、cTnT、α-SMA、v WF等特異性標(biāo)記蛋白,提示該細胞具有向心肌細胞、平滑肌細胞及內(nèi)皮細胞等多方向分化的潛能。4.本研究自原代組織塊中分離、培養(yǎng)、純化所得細胞經(jīng)流式細胞儀、Western Blot測定、多向分化潛能檢驗等過程鑒定為心肌干細胞。本研究探索出一種高效、統(tǒng)一的小型豬心肌干細胞體外培養(yǎng)及鑒定方法,對于臨床治療具有指導(dǎo)意義。
[Abstract]:Objective: myocardial stem cell regeneration therapy is a new treatment for myocardial infarction, but the number of myocardial stem cells is small and the expansion is difficult. Myocardial stem cells obtained in many laboratories in China have not been able to realize the identification of their multidirectional differentiation potential, so they can not be used as evidence of myocardial stem cells. The purpose of this study was to explore an efficient and stable culture method for myocardial stem cells of miniature pigs in vitro and to identify them systematically and to lay a foundation for cell biotherapy of myocardial infarction. Methods: adult Bama miniature pig, female, weight 25-30 kg. Primary myocardial stem cells were obtained from right auricular tissue by small incision forceps between the right second ribs after cardiac surgery. Primary myocardial stem cells were obtained by tissue block culture and cultured in the medium of myocardial stem cells, and then subcultured according to the condition of cell growth. After the third generation of purified cells were selected, the phenotype of the cells was identified by flow cytometry, the expression of specific transcription factors (Nkx2.5 and GATA-4) and the expression of specific transcription factors (Nkx2.5 and GATA-4) in the myocardium were detected by Western Blot, and the phenotype of the cells was identified by flow cytometry (FCM), and the expression of specific transcription factors (Nkx2.5 and GATA-4) was detected by Western Blot. The expression of CX43 cTnT, 偽 -SMA-vWF was detected by immunofluorescence after induction to observe the multidirectional differentiation potential of myocardial stem cells. The result is 1: 1. The primary cells isolated from the right atrial appendage of adult miniature pigs were observed under inverted microscope as "small, round and bright". The cells grew slowly. After passage, the cells became fusiform and grew more easily than the primary cells. The phenotype of the purified cells was identified by flow cytometry as c-kit CD34-CD45-CD31-CD90-Lineage-.3.Western Blot. The results showed that the expression of Nkx2.5 and GATA-4 was positive. 4. The purified cells were induced by different inducers to express cardiomyocyte specific protein CX43 and cTnT, smooth muscle cell specific protein 偽 -SMAand endothelial cell specific protein v WF. Conclusion 1. The cell phenotype of c-kit CD34-CD45-CD31-CD90-Lineage- was successfully isolated from adult miniature pig's right atrial appendage, and the positive expression of stem cell surface marker. 2. The cells obtained in this study were able to express Nkx2.5 and GATA-4, suggesting that the cells have the ability to regulate their early differentiation into cardiomyocytes. The cells were induced to express CX43 cTnT, 偽 -SMAV WF and other specific proteins, which indicated that the cells had the potential of differentiating into cardiomyocytes, smooth muscle cells and endothelial cells in many directions. The cells isolated, cultured and purified from primary tissue mass were identified as myocardial stem cells by flow cytometry (FCM) Western Blot assay and multidirectional differentiation potential test. In this study, an efficient and uniform method for the in vitro culture and identification of miniature porcine myocardial stem cells was explored, which is of guiding significance for clinical treatment.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R542.22

【共引文獻】

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本文編號：1901102