發(fā)布時(shí)間：2018-05-09 22:14

  本文選題：MiRNA + 再生障礙性貧血　； 參考：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：[研究背景]再生障礙性貧血(再障,aplastic anemia,AA)是一種由多種病因引起的獲得性骨髓衰竭綜合征,臨床表現(xiàn)為不同程度的全血細(xì)胞減少所致的貧血、出血和感染,尤其是重型再障,起病較急,進(jìn)展迅速,重度貧血、臟器出血以及嚴(yán)重感染發(fā)生率高,嚴(yán)重威脅患者的生命安全,是難治性血液系統(tǒng)疾病之一。再障發(fā)病呈世界性分布,國內(nèi)發(fā)病率遠(yuǎn)高于西方國家,并以中青年居多。再障發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,呈明顯異質(zhì)性和重疊性,主要概括為"種子""土壤"和"蟲子"三個(gè)方面:"種子"造血干細(xì)胞缺陷,包括造血干細(xì)胞量的減少和質(zhì)的缺陷;作為"土壤"的造血微環(huán)境異常,包括骨髓基質(zhì)細(xì)胞和造血生長因子的異常;而"蟲子"則代表紊亂的免疫功能,異常活化的T細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子使造血干細(xì)胞凋亡增多;此外某些遺傳因素也被認(rèn)為與再障的發(fā)病有關(guān)。近年來,隨著免疫學(xué)以及細(xì)胞遺傳學(xué)等技術(shù)的發(fā)展,再障的發(fā)病機(jī)制的研究獲得長足進(jìn)步,目前普遍認(rèn)為獲得性再障是一種T細(xì)胞異�；罨瘜�(dǎo)致的自身免疫性疾病,免疫攻擊的靶細(xì)胞主要是骨髓中的造血十/祖細(xì)胞。除此以外,許多潛在的自身抗原能夠誘導(dǎo)異常的免疫反應(yīng)進(jìn)而攻擊造血干/祖細(xì)胞,其相應(yīng)的自身抗體已被大量檢測到,提示B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫在再障發(fā)病中也起到一定作用。MicroRNA(miRNA)是一類序列高度保守的,長度約為19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA,通過和靶基因信使RNA(mRNA)堿基配對引導(dǎo)沉默復(fù)合體降解mRNA或阻遏其翻譯,從而對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的調(diào)控,參與生命過程中的許多重要進(jìn)程,包括早期發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化以及脂肪代謝等。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展,越來越多的miRNA分子及其作用被發(fā)現(xiàn),其中miR 146a和miR 182分別在固有免疫和適應(yīng)性免疫方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。既往研究表明在一些自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等,許多異常表達(dá)的miRNA通過作用于其靶基因參與疾病的發(fā)生發(fā)展,而miRNA與再障的相關(guān)性研究少有報(bào)道。本課題中我們首先收取3個(gè)重型再障患者和3個(gè)健康對照的骨髓T細(xì)胞,應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)篩選出兩組中差異表達(dá)的miRNA,經(jīng)擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證后得出miR34a表達(dá)量在再障骨髓T細(xì)胞中明顯升高,進(jìn)而進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)并建立再障的動物模型,探討miR34a及其靶基因在再障發(fā)病機(jī)制中的作用,明確miR34a介導(dǎo)T細(xì)胞活化的分子機(jī)制,為近一步闡明再障的免疫發(fā)病機(jī)制以及再障的靶向治療提供了理論依據(jù)。人白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen.HLA)-G是一種非經(jīng)典的HLA I類基因,不同于經(jīng)典的HLAI類基因,HLA-G表現(xiàn)為低度多態(tài)性,其編碼蛋白主要存在于母胎界面的滋養(yǎng)層細(xì)胞、胸腺、角膜、胰腺以及紅系祖細(xì)胞和內(nèi)皮前體細(xì)胞。HLA-G分子有七種異構(gòu)體,包括4種膜表面蛋白和3種可溶性蛋白,通過直接作用于表達(dá)其抑制性受體免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄子(immunoglobulin-like transcripts,ILTs)的細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制效應(yīng),誘導(dǎo)免疫耐受。ILTs主要包括三種:ILT2(LILRB1/CD85j),ILT-4(LILRB2/CD85d)和 KIR2DL4(CD158d),其中ILT2主要見于NK細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞,ILT4主要見于單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。近年來隨著研究深入,HLA-G/ILTs的免疫抑制作用受到越來越多的關(guān)注,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在器官移植、腫瘤、病毒和細(xì)菌感染以及自身免疫性疾病等病理情況下HLA-G蛋白表達(dá)異常,影響T、B、NK等免疫細(xì)胞的正常作用,從而誘導(dǎo)免疫耐受和腫瘤的免疫逃逸等。再障是一種免疫紊亂導(dǎo)致的造血衰竭綜合征,目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道HLA-G是否參與再障發(fā)生發(fā)展,本課題通過檢測再障患者骨髓和外周血細(xì)胞中HLA-G及其受體的表達(dá)情況,初步探討HLA-G/ILTs在再障免疫紊亂中發(fā)揮的作用,有可能為再障的免疫機(jī)制研究開辟新的領(lǐng)域。第一部分:AA中miR34a/DGK ζ增強(qiáng)骨髓T細(xì)胞活化的作用及機(jī)制研究研究目的:通過miRNA芯片技術(shù)篩選出AA骨髓T細(xì)胞中異常表達(dá)的miRNA分子,擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證該miRNA分子的表達(dá)量,分析其與臨床特征的關(guān)系,通過臨床標(biāo)本檢測以及建立再生障礙性貧血的動物模型,明確該miRNA分子在AA骨髓T細(xì)胞活化中的作用,近一步確定該miRNA的靶基因并探討其參與T細(xì)胞活化的分子機(jī)制,從而為AA的免疫機(jī)制研究提供新的思路。研究方法:1.標(biāo)本采集:收集49例AA患者和28例健康對照的骨髓標(biāo)本,其中49例AA患者中包括33位重型再障患者和16位非重型再障患者。2.篩選miRNA分子:取3例重型再障患者和3例健康對照的骨髓單個(gè)核細(xì)胞,經(jīng)免疫磁珠分選出CD3+T細(xì)胞,應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)篩選兩組骨髓CD3+T細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA分子。3.驗(yàn)證芯片結(jié)果:實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)法檢測骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR34a的表達(dá)情況,并分析miR34a與再障患者臨床特征的相關(guān)性。4.確定miR34a在骨髓naive T細(xì)胞的表達(dá)情況:免疫磁珠分選8例重型再障患者和8例正常人naive T和non-naive T細(xì)胞,應(yīng)用PCR檢測naive T和non-naive T細(xì)胞在兩組中的表達(dá)量,明確miR34a表達(dá)重升高并非AA骨髓T細(xì)胞活化所致的反應(yīng)性升高。5.確定miR34a在AA中發(fā)揮作用的靶基因:應(yīng)用PCR及免疫印跡法(western blot)檢測miR34a可能的靶基因二酯酷甘油激酶(diacylglycerol kinase.DGK)ζ在骨髓單個(gè)核細(xì)胞的表達(dá)水平,并分析miR34a和DGKζ表達(dá)相關(guān)性。6.體外功能實(shí)驗(yàn)探究miR34a在AA骨髓T細(xì)胞活化中的作用6.1慢病毒轉(zhuǎn)染AA骨髓單個(gè)核細(xì)胞:將含有miR34a抑制序列和無義序列的慢病毒轉(zhuǎn)染AA骨髓單個(gè)核細(xì)胞,5天后收集細(xì)胞后在熒光顯微鏡下觀察并用流式細(xì)胞術(shù)檢測慢病毒轉(zhuǎn)染效率。6.2流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞活化:收集細(xì)胞后標(biāo)記CD4和CD8以及T細(xì)胞活化的標(biāo)志分子CD25和CD69,比較兩組中CD4+和CD8+T細(xì)胞的活化水平。7.比較miR34a基因敲除小鼠(miR34a-/-)和正常野生小鼠(wild-type,WT)在骨髓造血系統(tǒng)的區(qū)別:進(jìn)行外周血細(xì)胞和骨髓造血干/祖細(xì)胞計(jì)數(shù),同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組外周血、骨髓、脾臟、淋巴結(jié)等處的CD4+和CD8+細(xì)胞的比例。8.小鼠體外功能試驗(yàn)探究miR34a在T細(xì)胞活化中的作用:取miR34a-/-和WT小鼠的脾臟和淋巴結(jié)細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)板中,加入anti-CD3和anti-CD8 mAbs刺激T細(xì)胞活化,比較兩組T細(xì)胞活化狀態(tài)、增殖情況以及下游信號分子的表達(dá)水平。8.1 T細(xì)胞表面活化標(biāo)志檢測:應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞表面CD25和CD69的表達(dá)水平。8.2 T細(xì)胞增殖檢測:應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)直接檢測兩組T細(xì)胞Brdu的摻入率以及CFSE標(biāo)染后應(yīng)用流式觀察細(xì)胞分裂以明確miR34a對T細(xì)胞增殖的影響。8.3 T細(xì)胞活化信號通路中分子檢測:應(yīng)用western blot檢測兩組細(xì)胞中DGKζ的表達(dá)量以及下游信號分子ERK的磷酸化水平。9.構(gòu)建再障的動物模型:將miR34a-/-和WT小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注入經(jīng)亞致死量照射的半相合受體鼠,監(jiān)測小鼠血常規(guī)變化,12天后比較兩組小鼠骨髓造血情況以及T細(xì)胞增殖情況。將小鼠股骨進(jìn)行石蠟包埋切片后HE染色觀察骨髓增生情況,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組小鼠骨髓中造血干/祖細(xì)胞比例和數(shù)量,同時(shí)檢測兩組中T細(xì)胞的比例。結(jié)果:1.芯片結(jié)果:應(yīng)用芯片技術(shù)在重型再障和健康對照骨髓T細(xì)胞之間篩選出31個(gè)表達(dá)明顯差異的miRNA分子,其中16個(gè)過表達(dá)而15個(gè)表達(dá)水平降低。2.驗(yàn)證芯片結(jié)果:RT-PCR檢測miR34a表達(dá)量在AA中明顯升高,且在重型再障組和非重型再障組之間差別較大。同時(shí)miR34a水平與再障患者的外周血中性粒細(xì)胞數(shù)和網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)均成反比。但在AA組中miR34a水平在naive T細(xì)胞和non-naive T細(xì)胞之間無明顯差別。3.確定靶基因:參照既往文獻(xiàn)報(bào)道和生物信息學(xué)軟件分析,選取7個(gè)基因作為候選基因,其中DGKζ mRNA水平在AA組中明顯低于健康對照組且與miR34a水平成負(fù)相關(guān),AA骨髓單個(gè)核細(xì)胞中DGKζ蛋白含量亦明顯降低。同時(shí)AA組骨髓T細(xì)胞表達(dá)CD69水平明顯高于對照組。4.下調(diào)再障骨髓T細(xì)胞中miR34a的表達(dá)量使T細(xì)胞活化水平降低:轉(zhuǎn)入miR34a抑制序列的再障骨髓T細(xì)胞表達(dá)DGKζ明顯增多,其表面CD69和CD25表達(dá)量明顯降低。5.MiR34a-/-小鼠和野生型小鼠骨髓造血細(xì)胞量的比較:miR34a-/-小鼠外周血和骨髓中CD4+T細(xì)胞的比例較野生小鼠明顯降低,而在外周血各系細(xì)胞數(shù)、骨髓有核細(xì)胞數(shù)、骨髓造血干/祖細(xì)胞數(shù)以及CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在脾臟和淋巴結(jié)等處的比例在兩組均無明顯差別。6.MiR34a-/-小鼠的體外功能實(shí)驗(yàn)證明miR34a敲除能夠顯著降低小鼠T細(xì)胞的活化水平和增殖能力:小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞在體外經(jīng)anti-CD3和anti-CD8 mAbs刺激后,miR34a-/-組T細(xì)胞表面的CD69和CD25水平較野生組明顯降低,Brdu摻入率亦明顯減低,CFSE染色顯示miR34a-/-組細(xì)胞分裂率明顯低于野生組。除此以外,作為降解二脂酰甘油(diacylglycerol,DAG)的重要激酶DGKζ在T細(xì)胞活化以后明顯降低,但在miR34a-/-組其降低幅度明顯小于野生組,同時(shí)T細(xì)胞活化信號通路中的下游分子ERK的磷酸化水平在MiR34a-/-組明顯低于對照組。7.再障動物模型中miR34a敲除使T細(xì)胞功能減弱:應(yīng)用野生型和miR34a敲除的淋巴結(jié)細(xì)胞均可成功構(gòu)建再障動物模型,兩種淋巴細(xì)胞均可在受體鼠骨髓中攻擊造血干/組細(xì)胞,但在miR34a-/-組受體鼠骨髓中造血干/組細(xì)胞比例和數(shù)量明顯高于野生組,同時(shí)miR34a-/-組骨髓中CD8+T細(xì)胞比例明顯低于野生組。結(jié)論:1.再障患者和健康對照的骨髓T細(xì)胞miRNA表達(dá)譜存在明顯差異,提示miRNA分子可能參與AA中T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫紊亂。2.逆轉(zhuǎn)AA骨髓T細(xì)胞中miR34a的表達(dá)水平可以明顯降低T細(xì)胞的活化水平。3.再障動物模型的建立更加證明了 miR34a基因敲除后T細(xì)胞活化增殖能力減弱。4.再障中升高的miR34a通過作用于DGKζ顯著增強(qiáng)了 T細(xì)胞的活化水平,從而在AA的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,有望成為AA治療的新靶點(diǎn)。第二部分:AA中HLA-G/ILT2抑制骨髓B細(xì)胞生長的作用及機(jī)制研究研究目的:明確HLA-G及其受體ILT2、ILT4在AA骨髓和外周血中的表達(dá)情況,探究HLA-G/ILT2相互作用對AA骨髓中B細(xì)胞的影響以及可能的分子機(jī)制,為再障的免疫機(jī)制研究提供新的方向。研究方法:1.標(biāo)本采集:收集46例再障患者和28例正常對照的外周血和骨髓,其中包括31例重型再障患者和15例非重型再障患者,分離血漿、骨髓上清和單個(gè)核細(xì)胞。2.應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測再障組和對照組骨髓上清和外周血漿中可溶性HLA-G的水平。3.應(yīng)用real-time PCR檢測再障組和對照組骨髓和外周血單個(gè)核細(xì)胞中HLA-G、ILT2和ILT4在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量。4.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測再障組和對照組骨髓和外周血單個(gè)核細(xì)胞表面HLA-G、ILT2和ILT4蛋白的表達(dá)量。5.應(yīng)用流式抗體標(biāo)染再障患者和健康對照骨髓中CD19+B細(xì)胞表面的sIgD和sIgM.以此將CD19+細(xì)胞分為祖/前B細(xì)胞、未成熟B細(xì)胞和成熟B細(xì)胞,同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測ILT2在各群細(xì)胞的表達(dá)量。6.體外功能實(shí)驗(yàn):從正常對照骨髓單個(gè)核細(xì)胞中應(yīng)用免疫磁珠分選CD19+ B細(xì)胞,將其種于鋪有OP9基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)板中,同時(shí)加入細(xì)胞因子IL-7、SCF和Flt3-L。實(shí)驗(yàn)組加入重組人HLA-G蛋白或含有高濃度HLA-G的再障患者骨髓上清,通過比較各組B細(xì)胞Brdu的摻入率明確HLA-G對B細(xì)胞生長的作用。除此之外,應(yīng)用anti-ILT2和anti-HLA-G中和抗體阻斷HLA-G/ILT2的結(jié)合,比較阻斷組和非阻斷組B細(xì)胞Brdu摻入率證明HLA-G對B細(xì)胞生長的作用。研究結(jié)果:1.可溶性HLA-G在再障骨髓上清中明顯高于正常對照組,但在外周血漿中兩組無明顯差別,同時(shí)發(fā)現(xiàn)在骨髓上清中可溶性HLA-G水平明顯高于外周血漿,提示可溶性HLA-G在骨髓和外周血中分布不均,在此二處對免疫細(xì)胞的作用強(qiáng)度可能不同。2.再障組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中ILT2mRNA的表達(dá)量明顯高于對照組,外周血中無明顯差別;同時(shí)外周血和骨髓中ILT4 mRNA的表達(dá)量在兩組中無明顯差異。3.再障組骨髓B細(xì)胞表達(dá)ILT2蛋白的比例明顯高于對照組,CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和CD14+單核細(xì)胞表面ILT2、ILT4蛋白水平在兩組無明顯差異,外周血單個(gè)核細(xì)胞中亦無明顯差異。4.再障骨髓B細(xì)胞各亞群比例呈現(xiàn)異常,成熟B細(xì)胞比例明顯增高,而原/祖B細(xì)胞比例明顯降低;同時(shí)各亞群表達(dá)ILT2的水平有差異,對照組成熟B細(xì)胞表達(dá)ILT2水平最高,未成熟B細(xì)胞次之,原/祖B細(xì)胞最低,而在再障組成熟B細(xì)胞表達(dá)ILT2水平與對照組無異,而原/祖B細(xì)胞和未成熟B細(xì)胞表達(dá)ILT2明顯增高。5.HLA-G/ILT2相互作用抑制骨髓B細(xì)胞的生長:與空白對照相比,與重組人HLA-G蛋白或含有高濃度HLA-G的再障患者骨髓上清共孵育的骨髓B細(xì)胞Brdu摻入率明顯降低,而應(yīng)用anti-ILT2或anti-HLA-G抗體干擾HLA-G和ILT2結(jié)合的阻斷組B細(xì)胞Brdu摻入率明顯高于非阻斷組。同時(shí)與富含sHLA-G的再障骨髓上清共培養(yǎng)的正常骨髓B細(xì)胞的Brdu摻入率較加入正常對照骨髓上清組明顯下降。結(jié)論:1.具有免疫抑制作用的HLA-G及其受體ILT2在再障骨髓中異常表達(dá),提示HLA-G/ILT2可能參與再障免疫紊亂狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展。2.體外功能實(shí)驗(yàn)證明可溶性HLA-G與骨髓B細(xì)胞表面ILT2結(jié)合能夠抑制骨髓B細(xì)胞的生長,提不再障骨髓上清中異常升高的可溶性HLA-G作用于高表達(dá)IILT2的原/祖B細(xì)胞和未成熟B細(xì)胞從而抑制其生長,最終導(dǎo)致原/祖B細(xì)胞和未成熟B細(xì)胞明顯減少,而成熟B細(xì)胞比例相對增高。3.抑制HLA-G和ILT2結(jié)合有助于再障骨髓B細(xì)胞數(shù)量的恢復(fù),為再障B細(xì)胞相關(guān)免疫機(jī)制研究提供了新方向。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R556.5
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本文編號：1867650