本文選題：移植性血管病 + 內(nèi)膜��； 參考：《山東大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景血管及臟器移植術(shù)后往往會發(fā)生移植血管再狹窄即移植性血管病(transplant vasculopathy,TV),是造成移植器官慢性失去功能的主要原因,目前TV發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機制尚未完全清楚。前期研究發(fā)現(xiàn),移植術(shù)后早期即存在血管外膜炎癥,外膜的巨噬細胞浸潤可能在移植性血管病發(fā)生中起關(guān)鍵作用。因此,本課題采用動脈血管移植模型,通過體內(nèi)、外實驗證明血管外膜早期的單核巨噬細胞浸潤在促進TV病變發(fā)生過程中具有因果作用,并以microRNA(miR)-21為例,進一步證實外膜巨噬細胞通過調(diào)節(jié)血管壁細胞(主要針對平滑肌細胞和成纖維細胞)miR的表達促進移植血管內(nèi)膜重塑的相關(guān)機制。研究目的1.確定抑制早期外膜巨噬細胞浸潤聚集能否抑制移植血管的內(nèi)膜重塑。2.明確巨噬細胞調(diào)節(jié)血管壁細胞miR表達的機制。3.檢測通過外膜途徑抑制miR的表達,能否抑制TV的發(fā)生發(fā)展。研究方法體內(nèi)實驗:建立大鼠胸-腹主動脈移植模型,氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(clodronate liposomes)用于體內(nèi)巨噬細胞耗竭。對移植大鼠進行隨機分組:巨噬細胞耗竭組(clodronate liposomes)、miR-21 抑制組(miR-21 inhibitor)、及其相應(yīng)對照組(control liposomes/control miRNA)。取 0、1、2、3、7、14 天移植血管進行HE染色。測量移植血管的各層增生情況;免疫組織化學(xué)染色檢測CD3,CD68,proliferating cell nuclear antigen(PCNA),monocyte chemotactic protein-1(MCP-1),vascular cell adhesion molecule-1(VCAM-1),intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1),α-smooth muscle actin(α-SM actin)的表達。分離血管外膜和中膜組織,QRT-PCR檢測miR-21,MCP-1,VCAM-1,ICAM-1的表達。體外實驗:分離大鼠胸主動脈外膜和中膜組織,分別做原代細胞培養(yǎng)。制作RAW264.0巨噬細胞條件培養(yǎng)基,ELISA檢測條件培養(yǎng)基內(nèi)各類細胞因子的含量,如:tumor necrosis factor-α(TNF-α),transforming growth factor-β1(TGF-β)等。用TNF-α細胞因子刺激外膜的成纖維細胞/中膜的平滑肌細胞,QRT-PCR檢測miR-21表達;條件培養(yǎng)基培養(yǎng)外膜成纖維細胞/中膜平滑肌細胞,實驗組加入TNF-α中和抗體,QRT-PCR檢測miR-21表達。TNF-α刺激外膜成纖維細胞/中膜平滑肌細胞,實驗組轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor,EDU和Transwell檢測細胞的增殖、遷移能力,QRT-PCR 檢測 miR-21,MCP-1,VCAM-1,ICAM-1,CCL-5。外膜成纖維細胞/中膜平滑肌細胞轉(zhuǎn)染miR-21 mimic,QRT-PCR檢測MCP-1,VCAM-1,ICAM-1。研究結(jié)果1.巨噬細胞耗竭能夠減輕血管內(nèi)膜的增生和移植導(dǎo)致的外膜炎癥。巨噬細胞耗竭顯著降低血管壁miR-21的表達。QRT-PCR結(jié)果顯示,體內(nèi)干預(yù)耗竭巨噬細胞后MCP-1,VCAM-1,ICAM-1的表達均降低。與其空白對照組相比,miR-21抑制劑干預(yù)后血管內(nèi)膜增生也顯著減弱;免疫組化結(jié)果顯示,與其對照組相比,巨噬細胞耗竭組和miR-21抑制組CD68,PCNA,MCP-1,VCAM-1,ICAM-1的表達均減少。2.巨噬細胞通過旁分泌TNF-α調(diào)節(jié)miR-21在外膜的成纖維細胞和中膜的平滑肌細胞中的表達。ELISA結(jié)果顯示,巨噬細胞條件培養(yǎng)基中含有TNF-α等細胞因子;QRT-PCR結(jié)果顯示,TNF-α可上調(diào)miR-21在外膜的成纖維細胞和中膜的平滑肌細胞中的表達;條件培養(yǎng)基培養(yǎng)外膜的成纖維細胞及中膜的平滑肌細胞,QRT-PCR結(jié)果顯示,添加TNF-α中和抗體組miR-21的表達下調(diào)。3.沉默miR-21可抑制TNF-α導(dǎo)致的外膜的成纖維細胞及中膜的平滑肌細胞增殖、遷移及炎癥反應(yīng)。TNF-α刺激外膜成纖維細胞及中膜平滑肌細胞,EDU和Transwell結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor組外膜的成纖維細胞及中膜的平滑肌細胞的增殖和遷移能力均減弱;QRT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor組外膜的成纖維細胞/中膜的平滑肌細胞的miR-21,MCP-1,VCAM-1,ICAM-1表達均降低。4.miR-21可以促進外膜的成纖維細胞/中膜的平滑肌細胞的炎癥反應(yīng)。QRT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-21 mimic組,外膜成纖維細胞MCP-I,VCAM-1表達上調(diào),中膜平滑肌細胞MCP-1表達上調(diào)。研究結(jié)論1.移植血管外膜巨噬細胞在新生內(nèi)膜發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。2.巨噬細胞通過旁分泌TNF-α調(diào)節(jié)血管壁細胞miR-21的表達,進而調(diào)節(jié)血管壁細胞的功能變化及炎癥反應(yīng)。3.血管壁細胞中表達的miR-21可能通過影響移植血管的炎癥反應(yīng)及其功能變化,進一步促進新生內(nèi)膜重塑。
[Abstract]:Background blood vessel restenosis, transplant vasculopathy (TV), is the main cause of chronic loss of function of transplanted organs. The biological mechanism of TV development is not completely clear at present. Early study found that angioepicarditis existed early after transplantation. The infiltration of macrophages in the outer membrane may play a key role in the occurrence of transplantation of vascular disease. Therefore, this subject uses an arterial vessel transplantation model. Through the body and in vitro experiments, it is proved that the early mononuclear macrophage infiltration in the epicardial membrane plays a causal role in promoting the occurrence of TV lesions, and is further confirmed by microRNA (miR) -21 as an example. Epicardium macrophages regulate the remodeling of vascular intima by regulating the expression of miR in vascular wall cells (mainly for smooth muscle cells and fibroblasts). Objective 1. to determine whether inhibition of infiltration and aggregation of early membrane macrophages inhibits the remodeling of the intima of the transplanted blood vessels.2. clearly regulates the miR surface of the vascular wall cells by macrophages The mechanism.3. detects the inhibition of the expression of miR through the outer membrane pathway and inhibits the development of TV. In vivo experiments in vivo: a rat thoracic abdominal aorta transplantation model was established, and chlorphosphonic acid two liposomes (clodronate liposomes) was used for the depletion of macrophages in the body. A randomized grouping of transplanted rats: a macrophage depletion group (clodronate L). Iposomes), the miR-21 inhibition group (miR-21 inhibitor), and its corresponding control group (control liposomes/control miRNA). Take the 0,1,2,3,7,14 day transplant vessels for HE staining and measure the proliferation of the various layers of the transplanted vessels. CP-1), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), alpha -smooth muscle (alpha -smooth muscle) expression. RAW264.0 macrophage conditioned medium was produced, and the contents of all kinds of cytokines in the conditioned medium were detected by ELISA, such as tumor necrosis factor- alpha (TNF- alpha), transforming growth factor- beta 1 (TGF- beta), etc., and the smooth muscle cells of the fibroblasts / middle membranes were stimulated with TNF- alpha cytokine, and the QRT-PCR detected the expression; The culture medium cultured outer membrane fibroblast / middle membrane smooth muscle cells, the experimental group added TNF- alpha neutralizing antibody, and QRT-PCR detected miR-21 expression.TNF- alpha stimulated outer membrane fibroblasts / middle membrane smooth muscle cells. The experimental group transfected miR-21 inhibitor, EDU and Transwell detected the cell proliferation, migration ability, QRT-PCR detected miR-21, MCP-1, VCAM-1, etc. -5. adventitial fibroblasts / medium membrane smooth muscle cells transfected with miR-21 mimic, QRT-PCR detection MCP-1, VCAM-1, ICAM-1. study results 1. macrophage depletion can reduce the proliferation of vascular intima and transplant the outer membrane inflammation. Macrophage depletion significantly reduces the expression of miR-21 in the vascular wall and the results show that the body intervention depleted macrophages in vivo The expression of post MCP-1, VCAM-1 and ICAM-1 decreased. Compared with the blank control group, the intima hyperplasia of the vascular endothelial cells decreased significantly after the intervention of miR-21 inhibitors. The immunohistochemical results showed that the expression of the macrophage depletion group and the miR-21 inhibition group CD68, the expression of PCNA, MCP-1, VCAM-1, ICAM-1 reduced the.2. macrophage through the paracrine TNF- alpha. The expression of miR-21 in the fibroblasts of the outer membrane and the smooth muscle cells of the middle membrane showed that the macrophage conditioned medium contained TNF- alpha and other cytokines. QRT-PCR results showed that TNF- alpha could increase the expression of miR-21 in the smooth muscle cells of the fibroblasts and middle membranes of the outer membrane; the conditioned medium cultured the outer membrane of the fibroblasts. The QRT-PCR results showed that the expression of TNF- alpha neutralizing antibody group miR-21 down regulated.3. silencing miR-21 could inhibit the proliferation, migration and inflammatory response of TNF- alpha induced fibroblasts and middle membrane smooth muscle cells, and.TNF- alpha stimulated the outer membrane fibroblasts and middle membrane smooth muscle cells, EDU and Transwell junction. The results showed that the proliferation and migration ability of the fibroblasts and middle membrane cells in the outer membrane of the miR-21 inhibitor group were weakened. The results of QRT-PCR showed that miR-21, MCP-1, VCAM-1, and ICAM-1 expressed in the fibroblasts / middle membranes of the outer membrane of the miR-21 inhibitor group and the.4.miR-21 could promote the fibroblasts of the outer membrane. The inflammatory response of cell / medium membrane smooth muscle cells.QRT-PCR results showed that the transfection of miR-21 mimic group, outer membrane fibroblast MCP-I, VCAM-1 expression up-regulated and the expression of MCP-1 in middle membrane smooth muscle cells up regulated. Conclusion 1. transplantation of vascular outer membrane macrophages plays an important role in the development of neointima by.2. macrophages passing through the paracrine TNF - alpha regulates the expression of miR-21 in vascular wall cells, and then regulates the functional changes of vascular wall cells and the expression of miR-21 in the inflammatory response.3. cell wall cells may further promote the remodeling of neointima by affecting the inflammatory response and its function changes in the transplanted blood vessels.

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R543

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本文編號：1822927