發(fā)布時(shí)間：2018-04-16 16:35

  本文選題：CEPO + 心肌細(xì)胞��； 參考：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：[目的]本實(shí)驗(yàn)通過在體外模擬一個(gè)近似人體內(nèi)高糖的特殊環(huán)境,觀察心肌細(xì)胞(Cardiaomyocyte,CM)在高糖環(huán)境下的生理及可能的病理情況,并進(jìn)一步探討氨甲�；偌t細(xì)胞生成素(Carbamylated erythropoietin C-EPO)對高糖環(huán)境誘導(dǎo)下體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞的作用及GSK-3 β/Smad3信號通路在其中的作用。為高糖促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大提供進(jìn)一步的理論支持、探究CEPO高糖環(huán)境對心臟重構(gòu)是否具有保護(hù)作用及可能的機(jī)制,并對糖尿病心肌病未來的治療方法提出可行的理論依據(jù)。[方法](1)CM的培養(yǎng):取出生1-3天的SD大鼠的心室肌,利用胰蛋白酶+Ⅱ型膠原酶雙酶消化法消化心肌組織,采用差速貼壁離心法分離,培養(yǎng)CM使用搏動(dòng)性良好的48h-72h細(xì)胞。(2)CEPO的合成:采用Leist法,利用EPO和氰酸鹽進(jìn)行合成。(3)藥物干預(yù):在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中利用高糖培養(yǎng)基(葡萄糖的終濃度25mmol/L)進(jìn)行培養(yǎng),誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大,在此過程中加入CEPO和/或GSK3 β信號通路阻滯劑SB216273進(jìn)行干預(yù)。分別將同一批細(xì)胞隨機(jī)分為6組:對照組(葡萄糖終濃度為5.5mmol/L)、高糖誘導(dǎo)組(葡萄糖終濃度為25mmol/L)、空白+CEPO 組(葡萄糖終濃度為 5.5mmol/L+20U/mlCEPO)、高糖+CEPO干預(yù)組(葡萄糖終濃度為25mmol/L+20U/ml CEPO)、高糖+EPO干預(yù)組(葡萄糖終濃度為25mmol/L+20U/mlEPO)、高糖+SB216763干預(yù)組(葡萄糖終濃度為 25mmol/L+3μMSB216763)。(4)蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase 3 βGSK-3β)及 GSK-3β/Smad3 信號通路中Smad3的表達(dá)并分析上述蛋白的相對表達(dá)量。(5)實(shí)時(shí)熒光定量PCR:將培養(yǎng)的CM細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)分組,給予藥物干預(yù)后提取細(xì)胞的總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測GSK-3 β、Smad3的mRNA的相對表達(dá)量。[結(jié)果](1)CM細(xì)胞分離培養(yǎng)后3-5h開始貼壁生長,培養(yǎng)24h后,細(xì)胞基本貼壁,少部分細(xì)胞伸出偽足,并開始出現(xiàn)自主搏動(dòng);繼續(xù)培養(yǎng)到60-72h,可見CM偽足交織成網(wǎng),視野內(nèi)90%細(xì)胞呈現(xiàn)同步搏動(dòng)。CM呈星型、多邊型等多種形態(tài),可自發(fā)性搏動(dòng)。(2)免疫組織化學(xué)法鑒定CM細(xì)胞:利用PV通用型兩步法免疫組織化學(xué)試劑盒鑒定CM細(xì)胞。免疫組化結(jié)果Fibronectin1(-)、Vimentin(-)、α-actin(+),證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為 CM 細(xì)胞。(3)Western blot 結(jié)果:①與空白對照組相比,高糖組GSK-3β的表達(dá)下降,Smad3、P-GSK-3β的表達(dá)升高;②與高糖組相比,CEPO組與EPO組GSK-3 β的表達(dá)均有明顯升高,Smad3表達(dá)下降,P-GSK-3 β的表達(dá)降低;③與EPO組相比,CEPO組GSK-3β表達(dá)升高更明顯,Smad3的表達(dá)下降較明顯,而P-GSK-3β的表達(dá)無明顯差異。[結(jié)論](1)CEPO、EPO可以抑制高糖環(huán)境下離體培養(yǎng)心肌細(xì)胞的肥大;(2)Smad3參與了心肌細(xì)胞肥大的病理過程,并且GSK-3 β可以直接抑制Smad3的表達(dá),GSK-3β是心肌細(xì)胞肥大的負(fù)向調(diào)節(jié)因子;(3)在抑制離體培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞肥大的過程中,CEPO的作用優(yōu)于EPO。
[Abstract]:[objective] to observe the physiological and pathological changes of cardiac myocyte cardiomyocyteus (CMCM) in high glucose environment by simulating a special environment similar to high glucose in human body in vitro.The effects of Carbamylated erythropoietin C-EPO) on cultured neonatal rat cardiomyocytes induced by high glucose environment and the role of GSK-3 尾 / Smad3 signaling pathway in vitro were further investigated.To provide further theoretical support for hypertrophy of cardiomyocytes promoted by high glucose, to explore the protective effect and possible mechanism of CEPO high glucose environment on cardiac remodeling, and to provide a feasible theoretical basis for the future treatment of diabetic cardiomyopathy.[methods] in vitro culture, ventricular muscle of Sprague-Dawley rats (1-3 days old) was taken out, myocardial tissue was digested by trypsin 鈪，

本文編號：1759774