本文選題：lncRNA + 心肌細(xì)胞增殖　； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)發(fā)病率占全球慢性非傳染性疾病的50%,死亡率位居全球最高。盡管有傳統(tǒng)針對(duì)心血管疾病的防治措施,但發(fā)病率仍然呈現(xiàn)逐年上升之勢(shì)。近年來(lái),越來(lái)越多的證據(jù)表明心血管早期發(fā)育異常與疾病發(fā)生密切相關(guān),因此,研究心血管發(fā)育有利于解析心血管疾病新的發(fā)病機(jī)制。哺乳動(dòng)物在出生后心肌細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷一個(gè)關(guān)鍵性的過(guò)渡期,在這個(gè)過(guò)渡期內(nèi)心臟會(huì)經(jīng)歷細(xì)胞生長(zhǎng)方式、線粒體動(dòng)態(tài)以及能量利用等過(guò)程的轉(zhuǎn)變,其中,在出生后早期心肌細(xì)胞即出現(xiàn)由增殖性生長(zhǎng)向肥厚性生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變,該轉(zhuǎn)變使得出生后7天內(nèi)的心肌損傷可以完全修復(fù)。該轉(zhuǎn)變過(guò)程可能受多種生長(zhǎng)因子、信號(hào)通路等的調(diào)控,然而,其精確的調(diào)控機(jī)制目前并不清楚。長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,lncRNA)是一類長(zhǎng)度大于200核苷酸的非編碼RNA,其作用機(jī)制多、調(diào)控范圍廣,具有重要的生物學(xué)功能,如調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、自噬等。近年研究發(fā)現(xiàn)lncRNA參與調(diào)控心臟發(fā)育和心臟疾病的發(fā)生發(fā)展,然而,其與出生后早期心臟增殖-肥厚轉(zhuǎn)變的關(guān)系目前并不清楚。本研究旨在探索lncRNA與該增殖-肥厚轉(zhuǎn)變的關(guān)系。方法和結(jié)果:1.出生后早期小鼠心臟lncRNA表達(dá)譜特征分析1.1出生后早期小鼠心臟lncRNA表達(dá)譜概況隨機(jī)取3窩出生后(P) 1天、7天、28天C57BL/6J小鼠心臟組織,RNA提取純化后做lncRNA芯片分析。芯片共檢測(cè)到來(lái)自University of California Santa Cruz,Refseq,Ensembl等多個(gè)數(shù)據(jù)的18,158個(gè)lncRNA的信號(hào),其中,大多數(shù)lncRNA長(zhǎng)度在200到3000個(gè)核苷酸之間。根據(jù)與鄰近基因的位置關(guān)系可將lncRNA劃分為多種形式,其中,絕大多數(shù)為基因間LncRNA(intergeniclncRNA),其數(shù)目在10000個(gè)以上。根據(jù)差異倍數(shù)、FDR(false discovery rate)值定義差異表達(dá)lncRNA為差異倍數(shù)2、FDR0.05,其中,P1、P7之間差異LncRNA個(gè)數(shù)為765, P7、P28之間差異lncRNA個(gè)數(shù)為4855。對(duì)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)芯片分析得到的數(shù)據(jù)做ANOVA處理后,共得到P1,P7及P28之間差異表達(dá)lncRNA 1146個(gè),其中,依次上調(diào)的253個(gè),依次下調(diào)的487個(gè),先上調(diào)后下調(diào)的315個(gè),先下調(diào)后上調(diào)的91個(gè)。1.2出生后早期小鼠心臟差異表達(dá)lncRNA的生物信息學(xué)分析針對(duì)P1,P7, P28三個(gè)時(shí)間點(diǎn)得到的1146個(gè)差異表達(dá)lncRNA和1358個(gè)差異表達(dá)mRNA進(jìn)行趨勢(shì)(the series test of cluster,STC)分析,各得到16種表達(dá)模塊,每個(gè)模塊對(duì)應(yīng)一種變化趨勢(shì)及其對(duì)應(yīng)的變化趨勢(shì)相似的lncRNA和mRNA。其中,lncRNA和mRNA各得到7個(gè)變化趨勢(shì)最顯著的表達(dá)模塊,這7個(gè)模塊在lncRNA和mRNA里變化趨勢(shì)一致。此外,lncRNA和mRNA變化趨勢(shì)最顯著的模塊也相同,P1到P7變化較平緩、P7到P28迅速下調(diào)。這些變化趨勢(shì)高度一致的差異lncRNA和mRNA提示它們之間可能存在相互作用關(guān)系。為進(jìn)一步探討lncRNA和mRNA的相互作用關(guān)系及其在心臟早期發(fā)育中的功能,我們進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)lncRNA和mRNA構(gòu)建了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),位于該網(wǎng)絡(luò)核心區(qū)的基因大多均參與心臟早期發(fā)育和細(xì)胞周期調(diào)控。從芯片結(jié)果得到1146個(gè)差異表達(dá)lncRNA共有879個(gè)鄰近基因,其中差異表達(dá)的鄰近基因有59個(gè)。在這59對(duì)lncRNA-鄰近基因中,35對(duì)lncRNA和鄰近基因隨時(shí)間變化趨勢(shì)正相關(guān),11對(duì)負(fù)相關(guān),這種正相關(guān)或負(fù)相關(guān)的關(guān)系提示lncRNA對(duì)鄰近基因可能的調(diào)控作用。其中,部分鄰近基因參與心臟早期發(fā)育,如Ccbe1,Vcan等。此外,我們還利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些差異表達(dá)的鄰近基因作了 gene ontology (GO)和Pathway分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些鄰近基因普遍參與細(xì)胞周期的調(diào)控過(guò)程如DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等,部分鄰近基因參與調(diào)控細(xì)胞增殖-肥厚轉(zhuǎn)變的通路如AMP-activated protein kinase(AMPK)。這些結(jié)果說(shuō)明差異表達(dá)lncRNA可能通過(guò)調(diào)控這些鄰近基因的表達(dá)進(jìn)而參與早期心臟發(fā)育。我們從轉(zhuǎn)錄因子的水平上探討差異表達(dá)lncRNA的上游調(diào)控機(jī)制,從共lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)里選取度最高的100個(gè)lncRNA和mRNA,分析其啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(上游1000bp至下游200bp)和轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor, TF),構(gòu)建TF-lncRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò),得到多個(gè)調(diào)控核心lncRNA和mRNA的TF。此外,根據(jù)TF,lncRNA,mRNA構(gòu)建的前饋環(huán)可以發(fā)現(xiàn),每個(gè)TF可調(diào)控多個(gè)差異表達(dá)lncRNA和mRNA,而每個(gè)差異表達(dá)lncRNA或mRNA可受多個(gè)TF調(diào)控。這些結(jié)果提示這三元之間的復(fù)雜關(guān)系構(gòu)成了調(diào)控心臟早期發(fā)育的分子網(wǎng)絡(luò)。2.出生后早期心臟lncRNA的驗(yàn)證、篩選及作用探索2.1 lncRNA芯片結(jié)果驗(yàn)證及組織特異性檢測(cè)選取芯片中P1到P28依次上調(diào)和依次下調(diào)差異表達(dá)倍數(shù)最高的各5個(gè)lncRNA,利用定量PCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證,其結(jié)果與芯片一致。在芯片結(jié)果中找出這10個(gè)lncRNA的差異表達(dá)鄰近基因,共得到3個(gè),利用定量PCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果與芯片也一致。為了篩選心肌特異性lncRNA,我們利用定量PCR技術(shù)在心、腎、血管、骨骼肌、肝、小腸6個(gè)組織中分別檢測(cè)這10個(gè)lncRNA的表達(dá),最后得到一個(gè)心肌特異性較高的lncRNA,ENSMUST00000117266。2.2 ENSMUST00000117266共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析選取皮爾森系數(shù)0.97以上的lncRNA和mRNA,構(gòu)建ENSMUST00000117266的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),共得到81個(gè)分子,其中44個(gè)是編碼基因。這些基因大多涉及心臟發(fā)育,如Hmga2參與胚胎期心臟發(fā)生和出生后的心臟發(fā)育,Ccbe1與心臟祖細(xì)胞特化有關(guān),Cited1對(duì)于胚胎心臟發(fā)育和存活十分關(guān)鍵等。這些結(jié)果提示ENSMUST00000117266可能參與心臟早期發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。2.3ENSMUST00000117266對(duì)缺氧、百草枯、心梗等心臟不利刺激敏感提取新生小鼠心臟做原代心肌細(xì)胞培養(yǎng),在缺氧條件刺激6小時(shí)后,ENSMUST00000117266mRNA水平顯著下調(diào)。新生小鼠出生后皮下連續(xù)三天注射自由氧(reactive oxygen series,ROS )誘導(dǎo)劑百草枯(paraquat ),心臟組織ENSMUST00000117266mRNA水平明顯下降。20周小鼠(不分性別)構(gòu)建心梗模型,發(fā)現(xiàn)心梗后2天心臟ENSMUST00000117266 mRNA水平明顯增多而3天后顯著下降。這些結(jié)果提示ENSMUST00000117266對(duì)于早期心臟應(yīng)對(duì)外界不利刺激十分敏感。2.4 ENSMUST00000117266參與調(diào)控心肌細(xì)胞增殖活性為了進(jìn)一步驗(yàn)證ENSMUST00000117266對(duì)出生后早期心臟增殖-肥厚轉(zhuǎn)變的影響,我們利用siRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染新生小鼠原代心肌細(xì)胞48小時(shí)后,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞周期活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ENSMUST00000117266敲低后,G1/G1期的心肌細(xì)胞明顯減少,G1/M期的心肌細(xì)胞顯著增多,S期的細(xì)胞無(wú)明顯改變。收取siRNA敲低后的心肌細(xì)胞,利用定量PCR檢測(cè)增殖相關(guān)基因Ccnd1、Myh10和肥厚相關(guān)基因Myh6、Myh7,結(jié)果發(fā)現(xiàn),ENSMUST00000117266敲低后心肌細(xì)胞Ccnd1 mRNA水平明顯下降。此外,利用rhBmp10處理心肌細(xì)胞6天增殖活性后再進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染,發(fā)現(xiàn)ENSMUST00000117266 敲低也可以顯著抑制 rhBmp10 上調(diào) Ccnd1、Myh10 以及 TGFβ通路的Nkx2.5、Mef2c的mRNA水平。這些結(jié)果提示ENSMUST00000117266參與調(diào)控心肌細(xì)胞的增殖活性。2.5 ENSMUST00000117266可以調(diào)控鄰近基因Sap301的表達(dá)提取新生小鼠心臟RNA,利用PCR技術(shù)進(jìn)行胞核胞漿檢測(cè),發(fā)現(xiàn)ENSMUST00000117266在胞核和胞漿分布大致均等。之后,分別利用siRNA和反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)技術(shù)轉(zhuǎn)染新生小鼠原代心肌細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48小時(shí)后檢測(cè)鄰近基因Hand1、Larp1、Sap301 mRNA水平改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn)siRNA和ASO技術(shù)均可敲低ENSMUST00000117266水平,且敲低后Sap301的mRNA水平顯著下降,提示ENSMUST00000117266可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后機(jī)制調(diào)控鄰近基因Sap301的表達(dá)。結(jié)論(1)通過(guò)lncRNA芯片分析,我們發(fā)現(xiàn)了出生后早期(P1, P7和P28)小鼠心臟的lncRNA差異表達(dá)譜;STC分析提示差異表達(dá)lncRNA與差異基因之間存在相互調(diào)控關(guān)系;GO、Pathway分析進(jìn)一步提示差異lncRNA可通過(guò)調(diào)控鄰近基因影響心臟增殖-肥厚轉(zhuǎn)變;利用轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)我們還發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)lncRNA可能的上游調(diào)控TF。(2)我們首次發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的心肌組織特異性lncRNA ENSMUST00000117266,共表達(dá)分析提示該lncRNA參與調(diào)控心臟發(fā)育相關(guān)基因,且其對(duì)缺氧、百草枯、心梗等不利刺激十分敏感;利用siRNA或ASO手段敲低心肌細(xì)胞ENSMUST00000117266活性后,我們發(fā)現(xiàn)其參與調(diào)控心肌細(xì)胞增殖活性,其機(jī)制與鄰近基因Sap301有關(guān)。
[Abstract]:蹇?jī)琛�綆＄柧鐥，

本文編號(hào)：1752681