本文選題：lncRNA + 心肌細胞增殖��； 參考：《第三軍醫(yī)大學》2017年博士論文

【摘要】：心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)發(fā)病率占全球慢性非傳染性疾病的50%,死亡率位居全球最高。盡管有傳統(tǒng)針對心血管疾病的防治措施,但發(fā)病率仍然呈現(xiàn)逐年上升之勢。近年來,越來越多的證據表明心血管早期發(fā)育異常與疾病發(fā)生密切相關,因此,研究心血管發(fā)育有利于解析心血管疾病新的發(fā)病機制。哺乳動物在出生后心肌細胞會經歷一個關鍵性的過渡期,在這個過渡期內心臟會經歷細胞生長方式、線粒體動態(tài)以及能量利用等過程的轉變,其中,在出生后早期心肌細胞即出現(xiàn)由增殖性生長向肥厚性生長的轉變,該轉變使得出生后7天內的心肌損傷可以完全修復。該轉變過程可能受多種生長因子、信號通路等的調控,然而,其精確的調控機制目前并不清楚。長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度大于200核苷酸的非編碼RNA,其作用機制多、調控范圍廣,具有重要的生物學功能,如調控細胞生長、分化、凋亡、自噬等。近年研究發(fā)現(xiàn)lncRNA參與調控心臟發(fā)育和心臟疾病的發(fā)生發(fā)展,然而,其與出生后早期心臟增殖-肥厚轉變的關系目前并不清楚。本研究旨在探索lncRNA與該增殖-肥厚轉變的關系。方法和結果:1.出生后早期小鼠心臟lncRNA表達譜特征分析1.1出生后早期小鼠心臟lncRNA表達譜概況隨機取3窩出生后(P) 1天、7天、28天C57BL/6J小鼠心臟組織,RNA提取純化后做lncRNA芯片分析。芯片共檢測到來自University of California Santa Cruz,Refseq,Ensembl等多個數(shù)據的18,158個lncRNA的信號,其中,大多數(shù)lncRNA長度在200到3000個核苷酸之間。根據與鄰近基因的位置關系可將lncRNA劃分為多種形式,其中,絕大多數(shù)為基因間LncRNA(intergeniclncRNA),其數(shù)目在10000個以上。根據差異倍數(shù)、FDR(false discovery rate)值定義差異表達lncRNA為差異倍數(shù)2、FDR0.05,其中,P1、P7之間差異LncRNA個數(shù)為765, P7、P28之間差異lncRNA個數(shù)為4855。對三個時間點芯片分析得到的數(shù)據做ANOVA處理后,共得到P1,P7及P28之間差異表達lncRNA 1146個,其中,依次上調的253個,依次下調的487個,先上調后下調的315個,先下調后上調的91個。1.2出生后早期小鼠心臟差異表達lncRNA的生物信息學分析針對P1,P7, P28三個時間點得到的1146個差異表達lncRNA和1358個差異表達mRNA進行趨勢(the series test of cluster,STC)分析,各得到16種表達模塊,每個模塊對應一種變化趨勢及其對應的變化趨勢相似的lncRNA和mRNA。其中,lncRNA和mRNA各得到7個變化趨勢最顯著的表達模塊,這7個模塊在lncRNA和mRNA里變化趨勢一致。此外,lncRNA和mRNA變化趨勢最顯著的模塊也相同,P1到P7變化較平緩、P7到P28迅速下調。這些變化趨勢高度一致的差異lncRNA和mRNA提示它們之間可能存在相互作用關系。為進一步探討lncRNA和mRNA的相互作用關系及其在心臟早期發(fā)育中的功能,我們進一步對差異表達lncRNA和mRNA構建了共表達網絡,位于該網絡核心區(qū)的基因大多均參與心臟早期發(fā)育和細胞周期調控。從芯片結果得到1146個差異表達lncRNA共有879個鄰近基因,其中差異表達的鄰近基因有59個。在這59對lncRNA-鄰近基因中,35對lncRNA和鄰近基因隨時間變化趨勢正相關,11對負相關,這種正相關或負相關的關系提示lncRNA對鄰近基因可能的調控作用。其中,部分鄰近基因參與心臟早期發(fā)育,如Ccbe1,Vcan等。此外,我們還利用KEGG數(shù)據庫對這些差異表達的鄰近基因作了 gene ontology (GO)和Pathway分析,結果發(fā)現(xiàn)這些鄰近基因普遍參與細胞周期的調控過程如DNA復制、轉錄等,部分鄰近基因參與調控細胞增殖-肥厚轉變的通路如AMP-activated protein kinase(AMPK)。這些結果說明差異表達lncRNA可能通過調控這些鄰近基因的表達進而參與早期心臟發(fā)育。我們從轉錄因子的水平上探討差異表達lncRNA的上游調控機制,從共lncRNA-mRNA共表達網絡里選取度最高的100個lncRNA和mRNA,分析其啟動子區(qū)域轉錄起始位點(上游1000bp至下游200bp)和轉錄因子(transcription factor, TF),構建TF-lncRNA-mRNA網絡,得到多個調控核心lncRNA和mRNA的TF。此外,根據TF,lncRNA,mRNA構建的前饋環(huán)可以發(fā)現(xiàn),每個TF可調控多個差異表達lncRNA和mRNA,而每個差異表達lncRNA或mRNA可受多個TF調控。這些結果提示這三元之間的復雜關系構成了調控心臟早期發(fā)育的分子網絡。2.出生后早期心臟lncRNA的驗證、篩選及作用探索2.1 lncRNA芯片結果驗證及組織特異性檢測選取芯片中P1到P28依次上調和依次下調差異表達倍數(shù)最高的各5個lncRNA,利用定量PCR技術進行驗證,其結果與芯片一致。在芯片結果中找出這10個lncRNA的差異表達鄰近基因,共得到3個,利用定量PCR技術進行驗證,結果與芯片也一致。為了篩選心肌特異性lncRNA,我們利用定量PCR技術在心、腎、血管、骨骼肌、肝、小腸6個組織中分別檢測這10個lncRNA的表達,最后得到一個心肌特異性較高的lncRNA,ENSMUST00000117266。2.2 ENSMUST00000117266共表達網絡分析選取皮爾森系數(shù)0.97以上的lncRNA和mRNA,構建ENSMUST00000117266的共表達網絡,共得到81個分子,其中44個是編碼基因。這些基因大多涉及心臟發(fā)育,如Hmga2參與胚胎期心臟發(fā)生和出生后的心臟發(fā)育,Ccbe1與心臟祖細胞特化有關,Cited1對于胚胎心臟發(fā)育和存活十分關鍵等。這些結果提示ENSMUST00000117266可能參與心臟早期發(fā)育的分子調控網絡。2.3ENSMUST00000117266對缺氧、百草枯、心梗等心臟不利刺激敏感提取新生小鼠心臟做原代心肌細胞培養(yǎng),在缺氧條件刺激6小時后,ENSMUST00000117266mRNA水平顯著下調。新生小鼠出生后皮下連續(xù)三天注射自由氧(reactive oxygen series,ROS )誘導劑百草枯(paraquat ),心臟組織ENSMUST00000117266mRNA水平明顯下降。20周小鼠(不分性別)構建心梗模型,發(fā)現(xiàn)心梗后2天心臟ENSMUST00000117266 mRNA水平明顯增多而3天后顯著下降。這些結果提示ENSMUST00000117266對于早期心臟應對外界不利刺激十分敏感。2.4 ENSMUST00000117266參與調控心肌細胞增殖活性為了進一步驗證ENSMUST00000117266對出生后早期心臟增殖-肥厚轉變的影響,我們利用siRNA技術轉染新生小鼠原代心肌細胞48小時后,利用流式細胞術檢測心肌細胞周期活性。結果發(fā)現(xiàn)ENSMUST00000117266敲低后,G1/G1期的心肌細胞明顯減少,G1/M期的心肌細胞顯著增多,S期的細胞無明顯改變。收取siRNA敲低后的心肌細胞,利用定量PCR檢測增殖相關基因Ccnd1、Myh10和肥厚相關基因Myh6、Myh7,結果發(fā)現(xiàn),ENSMUST00000117266敲低后心肌細胞Ccnd1 mRNA水平明顯下降。此外,利用rhBmp10處理心肌細胞6天增殖活性后再進行siRNA轉染,發(fā)現(xiàn)ENSMUST00000117266 敲低也可以顯著抑制 rhBmp10 上調 Ccnd1、Myh10 以及 TGFβ通路的Nkx2.5、Mef2c的mRNA水平。這些結果提示ENSMUST00000117266參與調控心肌細胞的增殖活性。2.5 ENSMUST00000117266可以調控鄰近基因Sap301的表達提取新生小鼠心臟RNA,利用PCR技術進行胞核胞漿檢測,發(fā)現(xiàn)ENSMUST00000117266在胞核和胞漿分布大致均等。之后,分別利用siRNA和反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)技術轉染新生小鼠原代心肌細胞,轉染48小時后檢測鄰近基因Hand1、Larp1、Sap301 mRNA水平改變,結果發(fā)現(xiàn)siRNA和ASO技術均可敲低ENSMUST00000117266水平,且敲低后Sap301的mRNA水平顯著下降,提示ENSMUST00000117266可以通過轉錄或轉錄后機制調控鄰近基因Sap301的表達。結論(1)通過lncRNA芯片分析,我們發(fā)現(xiàn)了出生后早期(P1, P7和P28)小鼠心臟的lncRNA差異表達譜;STC分析提示差異表達lncRNA與差異基因之間存在相互調控關系;GO、Pathway分析進一步提示差異lncRNA可通過調控鄰近基因影響心臟增殖-肥厚轉變;利用轉錄因子預測我們還發(fā)現(xiàn)了差異表達lncRNA可能的上游調控TF。(2)我們首次發(fā)現(xiàn)了一個新的心肌組織特異性lncRNA ENSMUST00000117266,共表達分析提示該lncRNA參與調控心臟發(fā)育相關基因,且其對缺氧、百草枯、心梗等不利刺激十分敏感;利用siRNA或ASO手段敲低心肌細胞ENSMUST00000117266活性后,我們發(fā)現(xiàn)其參與調控心肌細胞增殖活性,其機制與鄰近基因Sap301有關。
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本文編號：1752681