本文選題：胰島素抵抗　切入點(diǎn)：內(nèi)皮功能障礙　出處：《吉林大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：研究背景及目的： 內(nèi)皮功能障礙是多種心血管疾病,尤其是動(dòng)脈粥樣硬化病理過程發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)。近年來，胰島素抵抗被公認(rèn)為是多種代謝性疾病及心血管疾病的共同基礎(chǔ)。同時(shí)胰島素抵抗被證實(shí)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病因素之一。內(nèi)皮細(xì)胞作為胰島素的靶細(xì)胞，多項(xiàng)臨床和流行病學(xué)研究強(qiáng)烈支持內(nèi)皮功能障礙與胰島素抵抗之間存在密不可分的關(guān)系。然而，二者之間相互作用的病理生理過程尚不十分明確。阿托伐他汀，作為心血管保護(hù)藥物，是一個(gè)已應(yīng)用臨床多年的，經(jīng)典的他汀類降脂藥物。近年來有報(bào)道證實(shí)阿托伐他汀存在調(diào)脂外的血管內(nèi)皮保護(hù)作用，但有關(guān)阿托伐他汀對胰島素抵抗的內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制方面的研究較少。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)較復(fù)雜，研究個(gè)體差異大，不確定因素較多，然而體外實(shí)驗(yàn)方面，胰島素抵抗的內(nèi)皮細(xì)胞模型尚鮮見。目前應(yīng)用脂肪細(xì)胞、肝臟細(xì)胞制備胰島素抵抗模型的報(bào)道很多，主要關(guān)注點(diǎn)在于研究胰島素抵抗與糖脂代謝之間的關(guān)系。胰島素抵抗的內(nèi)皮細(xì)胞模型尚鮮見。本實(shí)驗(yàn)的第一部分，通過高葡萄糖聯(lián)合高胰島素刺激內(nèi)皮細(xì)胞，制備胰島素抵抗的內(nèi)皮細(xì)胞模型，破壞內(nèi)皮細(xì)胞的胰島素受體信號通路繼而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙。本實(shí)驗(yàn)的第二部分，，應(yīng)用阿托伐他汀作用胰島素抵抗的內(nèi)皮細(xì)胞，旨在探討阿托伐他汀對胰島素抵抗的血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及可能作用機(jī)制。 方法： HUVEC培養(yǎng)在分別含有5，15或30mM葡萄糖或聯(lián)合10-5M胰島素的培養(yǎng)基里培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去原培養(yǎng)基，各組重新加入含100nM胰島素的正常培養(yǎng)基刺激細(xì)胞30min后，由倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和MTT檢測細(xì)胞活力，再通過Westernblot對胰島素受體及其底物的磷酸化、Akt磷酸化、eNOS的磷酸化進(jìn)行檢測；eNOS試劑盒檢測eNOS活性；硝酸還原法檢測NO濃度；RT-PCR檢測內(nèi)皮細(xì)胞分泌ET-1mRNA的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中，將HUVEC在含有30mM的葡萄糖和10-5M胰島素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)被定義為胰島素抵抗的血管內(nèi)皮細(xì)胞即IR VEC。正常培養(yǎng)的HUVEC定義為Nor VEC.接下來將加入不同濃度的阿托伐他�。�0，10-6M，10-5M,10-4M）分別加入到Nor VEC和IR VEC中，刺激24小時(shí)或10-4M阿托伐他汀作用細(xì)胞24小時(shí)期間，檢測不同時(shí)間點(diǎn)（3h、6h、9h、12h、15h、18h、24h）上述指標(biāo)，觀察阿托伐他汀對胰島素信號通路的干預(yù)作用及對內(nèi)皮功能的影響。最后，應(yīng)用PI3k抑制劑LY294002封閉其信號通路，探討阿托伐他汀保護(hù)血管內(nèi)皮的作用機(jī)制。 結(jié)果： 1細(xì)胞分別培養(yǎng)在含有5、15、30mM的葡萄糖和（或）10-5M胰島素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。細(xì)胞形態(tài)及活細(xì)胞數(shù)量在各組間沒有明顯差異（p0.05）。 2與對照組相比，單獨(dú)30mM葡萄糖刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞顯著降低了胰島素受體（IR）及其底物(IRS1)的酪氨酸磷酸化表達(dá)，分別降低達(dá)60%和40%（p0.01）。與單獨(dú)培養(yǎng)在30mM葡萄糖培養(yǎng)基中的細(xì)胞相比，聯(lián)合了10-5M胰島素共同刺激細(xì)胞時(shí)，胰島素受體及其底物的酪氨酸磷酸化表達(dá)進(jìn)一步下降(p0.05)。 3與對照組相比，單獨(dú)30mM葡萄糖或者單獨(dú)10-5M胰島素刺激細(xì)胞，均使Akt的磷酸化表達(dá)降低，分別下降了近50%和30%。當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用30mM葡萄糖和10-5M胰島素共同刺激細(xì)胞時(shí)，Akt磷酸化的表達(dá)進(jìn)一步下降（p0.01）。 4與對照組相比，單獨(dú)30mM葡萄糖刺激細(xì)胞，使內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一氧化氮（NO）明顯下降（p0.05），聯(lián)合10-5M胰島素共同刺激后，NO濃度下降更為明顯（p0.01）。與此相反，相比于對照組，聯(lián)合30mM葡萄糖和10-5M胰島素刺激細(xì)胞，使ET-1mRNA的表達(dá)增加近13倍（p0.01）。 530mM葡萄糖刺激細(xì)胞，明顯降低eNOS的ser1177位點(diǎn)磷酸化表達(dá)(p0.05)，聯(lián)合10-5M胰島素刺激后表達(dá)水平進(jìn)一步下降(p0.01)。細(xì)胞在聯(lián)合30mM的葡萄糖和10-5M胰島素共同刺激下，eNOS的ser1177位點(diǎn)磷酸化水平降低至在5mM葡萄糖中培養(yǎng)的22％。與此同時(shí)，eNOS的活性變化與eNOS的磷酸化水平變化幾乎一致。 6阿托伐他汀使IR vec的胰島素受體及其底物的酪氨酸磷酸化的表達(dá)明顯增加（p0.01），不同劑量的阿托伐他汀組之間無明顯差異（P0.05）。 7阿托伐他汀使IR vec內(nèi)Akt的磷酸化表達(dá)明顯增高（p0.01）。 8阿托伐他汀顯著增加IR vec的NO產(chǎn)量呈正向劑量依賴性。與此相反，與未經(jīng)處理的IR vec相比，阿托伐他汀顯著降低ET-1的mRNA表達(dá)，對ET-1mRNA表達(dá)的最大抑制發(fā)生在10-4M組（抑制率為76％）。 9阿托伐他汀顯著增加eNOS的ser1177位點(diǎn)磷酸化及活性的表達(dá)呈劑量依賴性。 10在IR vec中，阿托伐他汀誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生，在用藥后的第3小時(shí)NO的濃度即開始升高，其最高水平在9小時(shí)后出現(xiàn)，并能持續(xù)此表達(dá)水平24小時(shí)。阿托伐他汀無論在Nor vec或IR vec中均降低ET-1mRNA水平。 11阿托伐他汀增加IR vec中eNOS的ser1177位點(diǎn)磷酸化及活性表達(dá)呈時(shí)間依賴性。 12LY294002部分抑制了阿托伐他汀誘導(dǎo)VEC和IR VEC細(xì)胞NO產(chǎn)生增加（P0.05）。同樣地，LY294002降低阿托伐他汀誘導(dǎo)的AKt的磷酸化表達(dá)、eNOS的ser1177位點(diǎn)磷酸化和eNOS的活性。然而，在ET-1mRNA表達(dá)的并未受到LY294002的影響（P0.05）。 結(jié)論： 1、在胰島素抵抗早期，胰島素抵抗并未引起細(xì)胞形態(tài)的改變，僅影響細(xì)胞功能發(fā)生障礙。 2、胰島素信號通路受損后血管內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生障礙，eNOS的ser1177位點(diǎn)的磷酸化表達(dá)減少及活性降低，內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO的產(chǎn)生降低，ET-1mRNA的表達(dá)增多。 3、當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞在胰島素抵抗的狀態(tài)下，胰島素信號通路受損導(dǎo)致胰島素受體（IR）、受體底物(IRS1)、蛋白激酶B（Akt）磷酸化表達(dá)減少。 4、阿托伐他汀可以改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的血管內(nèi)皮功能障礙，并呈量效及時(shí)效性。 5、阿托伐他汀可以明顯恢復(fù)受損的胰島素信號通路傳導(dǎo)，部分上調(diào)胰島素受體（IR）、受體底物(IRS1)、蛋白激酶B（Akt）磷酸化表達(dá)，改善胰島素抵抗。 6、阿托伐他汀具有對胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用，可能主要作用于PI3k/Akt/eNOS通路。
[Abstract]:Background and purpose of the study :

Insulin resistance is recognized as a common base for many metabolic diseases and cardiovascular diseases .

Method :

HUVEC were cultured for 24 hours in medium containing 5 , 15 or 30 mM glucose or 10 - 5M insulin respectively . After 30 min of stimulation of cells with normal medium containing 100 nM insulin , the cell morphology and MTT test cell viability were observed by an inverted microscope , then the phosphorylation of insulin receptor and its substrate was observed by Western blot , and phosphorylation of eNOS and phosphorylation of eNOS were detected by Western blot ;
eNOS assay was used to detect eNOS activity .
NO concentration was detected by nitrate reduction method .
The expression of ET - 1 mRNA was detected by RT - PCR . In this experiment , HUVEC were cultured in medium containing 30 mM glucose and 10 - 5M insulin for 24 hours .

Results :

Cells were cultured for 24 h in medium containing 5 , 15 , 30 mM glucose and / or 10 - 5M insulin , and no significant difference was found between the cell morphology and the number of viable cells ( p < 0.05 ) .

Compared with control group , 30 mM glucose stimulated vascular endothelial cells significantly reduced tyrosine phosphorylation of insulin receptor ( IR ) and its substrate ( IRS1 ) , decreased by 60 % and 40 % ( p0.01 ) , respectively . Compared with the cells cultured in 30 mM glucose medium alone , the expression of tyrosine phosphorylation of insulin receptor and its substrate decreased further ( p < 0.05 ) .

3 Compared with the control group , 30 mM glucose alone or 10 - 5M insulin stimulated the cells , which decreased the phosphorylation and decreased by nearly 50 % and 30 % , respectively . When combined with 30 mM glucose and 10 - 5M insulin to stimulate the cells , the expression of phosphorylation decreased further ( p . 01 ) .

In contrast to the control group , 30 mM glucose and 10 - 5M insulin stimulated the cells in combination with 30 mM glucose and 10 - 5M insulin to increase the expression of ET - 1 mRNA by nearly 13 times ( p0.01 ) .

At the same time , the phosphorylation level of ser1177 in eNOS decreased to 22 % in 5 mM glucose . At the same time , the change of eNOS activity was almost identical to that of eNOS .

The expression of tyrosine phosphorylation of IR vec insulin receptor and its substrate increased significantly ( P0.01 ) . There was no significant difference between atorvastatin group at different doses ( P0.05 ) .

7 - Atorvastatin increased the expression of phosphorylation in IR vec ( p0.01 ) .

In contrast , atorvastatin significantly reduced the mRNA expression of ET - 1 compared to untreated IR vec , and the maximum inhibition of ET - 1 mRNA expression was in the 10 - 4M group ( 76 % inhibition rate ) .

9 atorvastatin significantly increased the phosphorylation and activity of ser1177 sites of eNOS in a dose - dependent manner .

10 In IR vec , atorvastatin induced NO production , the concentration of NO at the 3rd hour after administration began to rise , the highest level appeared after 9 hours , and the expression level was sustained for 24 hours . Atorvastatin lowered the ET - 1 mRNA level in either Nor vec or IR vec .

11 Atorvastatin increased the phosphorylation of ser1177 and the time - dependent expression of eNOS in IR vec .

However , the expression of ET - 1 mRNA was not affected by the expression of ET - 1 mRNA ( P0.05 ) .

Conclusion :

1 . During the early period of insulin resistance , insulin resistance did not induce changes of cell morphology , and only affected the cellular function .

2 . After the insulin signal pathway was damaged , the endothelial function of endothelial cells was impaired , the expression of ser1177 of eNOS decreased and the activity was decreased , the secretion of NO in endothelial cells decreased , and the expression of ET - 1 mRNA increased .

3 . When vascular endothelial cells are in insulin resistance , insulin receptor ( IR ) , receptor substrate ( IRS1 ) and protein kinase B ( phosphorylation ) decrease in insulin signaling pathway .

4 . Atorvastatin can improve vascular endothelial dysfunction in insulin resistance , and can be dose - effective and time - effective .

5 . Atorvastatin can obviously recover the damaged insulin signaling pathway , partially up - regulate the expression of insulin receptor ( IR ) , receptor substrate ( IRS1 ) , protein kinase B , and improve insulin resistance .

6 . Atorvastatin has the protective effect on vascular endothelial cells under the condition of insulin resistance .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R54

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1729490