本文選題：糖尿病心肌病　切入點：Rho激酶　出處：《浙江大學》2016年博士論文

【摘要】：糖尿病是嚴重威脅人類健康的常見疾病。據(jù)統(tǒng)計,目前全球糖尿病患病人數(shù)超過3億,預計在2035年,總發(fā)病人數(shù)將達到6億人。糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy, DCM)是最常見的糖尿病心血管并發(fā)癥之一,是獨立于心臟瓣膜病、高血壓、冠狀動脈疾病而獨立存在的心臟損傷。臨床表現(xiàn)為早期的舒張功能障礙,晚期的收縮功能障礙以及心肌重構(gòu),并最終進展至終末期心功能不全。糖尿病心肌病發(fā)病機制復雜,其中,心肌細胞Ca2+離子穩(wěn)態(tài)的異常以及肌小節(jié)結(jié)構(gòu)損傷是糖尿病心肌病心功能不全的重要原因。一方面,糖尿病會導致肌漿網(wǎng)Ca2+ATP酶(Sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA)和鈉鈣交換體(Na+-Ca2+ exchanger, NCX)表達和功能下降,舒張期胞漿內(nèi)Ca2+清除延遲,肌漿網(wǎng)Ca2+回收功能下降,Ca2+儲備減少,Ca2+瞬變幅度下降。另一方面,糖尿病還會引起心肌細胞基本收縮單位-肌小節(jié)結(jié)構(gòu)和功能變化,比如橫橋結(jié)合與解離異常,肌動蛋白構(gòu)型改變以及排列紊亂等。上述變化最終會引起心肌細胞電興奮-收縮偶聯(lián)異常,并進而導致糖尿病心功能不全。Rho激酶(Rho kinase, ROCK)是小G蛋白家族中RhoA蛋白下游的效應分子。RhoA/ROCK信號通路的激活與多種心血管疾病密切相關(guān)。其中,RhoA/ROCK活性增高是導致糖尿病心臟收縮與舒張功能異常的重要原因,但是相關(guān)的機制仍有待進一步研究。近來,本課題組研究發(fā)現(xiàn)ROCK抑制劑法舒地爾能夠改善缺氧誘導的Ca2+瞬變幅度的下降以及肌漿網(wǎng)Ca2+儲備的減少,暗示了RhoA/ROCK信號通路可能參與了心肌細胞Ca2+轉(zhuǎn)運的調(diào)控。但是在糖尿病動物模型中,抑制RhoA/ROCK活性能否調(diào)控Ca2+轉(zhuǎn)運并進而改善糖尿病心功能不全目前尚不明確。另一方面, 在糖尿病心肌細胞中, 肌動蛋白構(gòu)型變化以及排列紊亂是導致肌小節(jié)收縮功能障礙的重要原因,那么,抑制RhoA/ROCK信號通路能否改善肌動蛋白重構(gòu)而緩解糖尿病心功能不全,仍有待進一步明確。在本研究中,我們選擇臨床廣泛使用的ROCK抑制劑-法舒地爾作為干預藥物來抑制糖尿病大鼠心臟組織中ROCK活性,從在體和單個心肌細胞水平上觀察法舒地爾對糖尿病心肌病的保護作用。隨后,通過檢測各組間Ca2+瞬變以及肌動蛋白構(gòu)型變化,來明確法舒地爾對糖尿病心肌病的保護機制,并在此基礎(chǔ)上對相關(guān)的信號通路進行探討。第一部分Rho激酶抑制劑法舒地爾對糖尿病大鼠心功能不全及鈣穩(wěn)態(tài)異常的作用目的探討法舒地爾對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠心功能不全和鈣穩(wěn)態(tài)異常的作用方法雄性8周齡Sprague-Dawley大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素70mg/kg,建立1型糖尿病動物模型,對照組腹腔注射等量的枸櫞酸鈉。造模1周后,將糖尿病大鼠按照血糖和體重配對,隨機分為2組,法舒地爾干預組(10mg/kg/d)和糖尿病組。分組后繼續(xù)治療8周。采用超聲心動圖及血流動力學檢測在體心功能。分離左心室單個心肌細胞,記錄單個心肌細胞的功能變化。以Fura-2為指示劑,用細胞鈣成像系統(tǒng)檢測心肌細胞鈣瞬變。用咖啡因誘導鈣瞬變的方法,間接評估鈉鈣交換體功能以及肌漿網(wǎng)鈣儲備水平。Western blotting半定量分析鈣離子轉(zhuǎn)運蛋白表達以及相應信號通路磷酸化水平變化。結(jié)果與正常對照組相比,糖尿病大鼠心臟組織RhoA和ROCK活性明顯增高,并且表現(xiàn)出心功能不全和單個心肌細胞功能障礙,心肌細胞鈣瞬變幅度下降,舒張期胞漿內(nèi)鈣離子清除延遲,肌漿網(wǎng)鈣儲備減少,NCX功能下降。與功能學變化相對應的是,糖尿病大鼠心臟組織中鈣離子轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白SERCA2、NCX、p-PLB、 p-Akt表達下降,PLB和p-PKCβ2表達增高。法舒地爾干預后,能夠顯著抑制RhoA和ROCK活性,改善糖尿病大鼠心功能不全和單個心肌細胞功能障礙,加快糖尿病心肌細胞舒張期胞漿內(nèi)鈣離子清除,緩解NCX功能,糾正SERCA2、NCX、 p-PLB、PLB、p-Akt和p-PKCβ2表達。但是法舒地爾對糖尿病引起的心肌細胞鈣瞬變幅度的下降和肌漿網(wǎng)鈣儲備的減少無明顯改善。結(jié)論法舒地爾通過抑制RhoA/ROCK活性,對糖尿病大鼠心臟組織具有保護作用。其對于舒張功能的改善可能是通過調(diào)節(jié)鈣離子轉(zhuǎn)運蛋白表達及活性,從而加快胞漿內(nèi)鈣離子清除而實現(xiàn)的。第二部分Rho激酶抑制劑法舒地爾對糖尿病大鼠心臟肌動蛋白重構(gòu)的影響目的探討法舒地爾在糖尿病心臟組織肌動蛋白構(gòu)型變化中的作用方法雄性8周齡Sprague-Dawley大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素70mg/kg,建立1型糖尿病動物模型,正常對照組腹腔注射等量的枸櫞酸鈉。造模1周后,將糖尿病大鼠按照血糖和體重配對,隨機分為2組,法舒地爾干預組(1 Omg/kg/d)和糖尿病組。8周后,取心臟標本,冰凍切片行鬼筆環(huán)肽染色,激光共聚焦顯微鏡觀察F-actin排列情況。超速離心法分離G-actin和F-actin。石蠟包埋切片行masson染色,評估左心室纖維化水平。Western blotting半定量分析肌動蛋白構(gòu)型變化和α-SMA表達變化。結(jié)果與正常對照組比較,糖尿病組大鼠心臟組織中F-actin排列紊亂,G-actin/F-actin比值下降,心臟間質(zhì)纖維化明顯,a-SMA表達增高。法舒地爾干預后,能有效恢復糖尿病心臟組織中F-actin排列,糾正G-actin/F-actin比值,抑制心肌間質(zhì)纖維化和α-SMA表達。結(jié)論法舒地爾能夠有效恢復糖尿病心臟組織中F-actin排列,改善肌動蛋白構(gòu)型變化,抑制心肌間質(zhì)纖維化,這可能是其改善糖尿病心肌病收縮與舒張功能障礙的部分機制。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R54

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本文編號：1706962