本文選題：糖尿病心肌病　切入點(diǎn)：Rho激酶　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：糖尿病是嚴(yán)重威脅人類健康的常見疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì),目前全球糖尿病患病人數(shù)超過3億,預(yù)計(jì)在2035年,總發(fā)病人數(shù)將達(dá)到6億人。糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy, DCM)是最常見的糖尿病心血管并發(fā)癥之一,是獨(dú)立于心臟瓣膜病、高血壓、冠狀動脈疾病而獨(dú)立存在的心臟損傷。臨床表現(xiàn)為早期的舒張功能障礙,晚期的收縮功能障礙以及心肌重構(gòu),并最終進(jìn)展至終末期心功能不全。糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,其中,心肌細(xì)胞Ca2+離子穩(wěn)態(tài)的異常以及肌小節(jié)結(jié)構(gòu)損傷是糖尿病心肌病心功能不全的重要原因。一方面,糖尿病會導(dǎo)致肌漿網(wǎng)Ca2+ATP酶(Sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA)和鈉鈣交換體(Na+-Ca2+ exchanger, NCX)表達(dá)和功能下降,舒張期胞漿內(nèi)Ca2+清除延遲,肌漿網(wǎng)Ca2+回收功能下降,Ca2+儲備減少,Ca2+瞬變幅度下降。另一方面,糖尿病還會引起心肌細(xì)胞基本收縮單位-肌小節(jié)結(jié)構(gòu)和功能變化,比如橫橋結(jié)合與解離異常,肌動蛋白構(gòu)型改變以及排列紊亂等。上述變化最終會引起心肌細(xì)胞電興奮-收縮偶聯(lián)異常,并進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病心功能不全。Rho激酶(Rho kinase, ROCK)是小G蛋白家族中RhoA蛋白下游的效應(yīng)分子。RhoA/ROCK信號通路的激活與多種心血管疾病密切相關(guān)。其中,RhoA/ROCK活性增高是導(dǎo)致糖尿病心臟收縮與舒張功能異常的重要原因,但是相關(guān)的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。近來,本課題組研究發(fā)現(xiàn)ROCK抑制劑法舒地爾能夠改善缺氧誘導(dǎo)的Ca2+瞬變幅度的下降以及肌漿網(wǎng)Ca2+儲備的減少,暗示了RhoA/ROCK信號通路可能參與了心肌細(xì)胞Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控。但是在糖尿病動物模型中,抑制RhoA/ROCK活性能否調(diào)控Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)并進(jìn)而改善糖尿病心功能不全目前尚不明確。另一方面, 在糖尿病心肌細(xì)胞中, 肌動蛋白構(gòu)型變化以及排列紊亂是導(dǎo)致肌小節(jié)收縮功能障礙的重要原因,那么,抑制RhoA/ROCK信號通路能否改善肌動蛋白重構(gòu)而緩解糖尿病心功能不全,仍有待進(jìn)一步明確。在本研究中,我們選擇臨床廣泛使用的ROCK抑制劑-法舒地爾作為干預(yù)藥物來抑制糖尿病大鼠心臟組織中ROCK活性,從在體和單個心肌細(xì)胞水平上觀察法舒地爾對糖尿病心肌病的保護(hù)作用。隨后,通過檢測各組間Ca2+瞬變以及肌動蛋白構(gòu)型變化,來明確法舒地爾對糖尿病心肌病的保護(hù)機(jī)制,并在此基礎(chǔ)上對相關(guān)的信號通路進(jìn)行探討。第一部分Rho激酶抑制劑法舒地爾對糖尿病大鼠心功能不全及鈣穩(wěn)態(tài)異常的作用目的探討法舒地爾對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心功能不全和鈣穩(wěn)態(tài)異常的作用方法雄性8周齡Sprague-Dawley大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素70mg/kg,建立1型糖尿病動物模型,對照組腹腔注射等量的枸櫞酸鈉。造模1周后,將糖尿病大鼠按照血糖和體重配對,隨機(jī)分為2組,法舒地爾干預(yù)組(10mg/kg/d)和糖尿病組。分組后繼續(xù)治療8周。采用超聲心動圖及血流動力學(xué)檢測在體心功能。分離左心室單個心肌細(xì)胞,記錄單個心肌細(xì)胞的功能變化。以Fura-2為指示劑,用細(xì)胞鈣成像系統(tǒng)檢測心肌細(xì)胞鈣瞬變。用咖啡因誘導(dǎo)鈣瞬變的方法,間接評估鈉鈣交換體功能以及肌漿網(wǎng)鈣儲備水平。Western blotting半定量分析鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)以及相應(yīng)信號通路磷酸化水平變化。結(jié)果與正常對照組相比,糖尿病大鼠心臟組織RhoA和ROCK活性明顯增高,并且表現(xiàn)出心功能不全和單個心肌細(xì)胞功能障礙,心肌細(xì)胞鈣瞬變幅度下降,舒張期胞漿內(nèi)鈣離子清除延遲,肌漿網(wǎng)鈣儲備減少,NCX功能下降。與功能學(xué)變化相對應(yīng)的是,糖尿病大鼠心臟組織中鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白SERCA2、NCX、p-PLB、 p-Akt表達(dá)下降,PLB和p-PKCβ2表達(dá)增高。法舒地爾干預(yù)后,能夠顯著抑制RhoA和ROCK活性,改善糖尿病大鼠心功能不全和單個心肌細(xì)胞功能障礙,加快糖尿病心肌細(xì)胞舒張期胞漿內(nèi)鈣離子清除,緩解NCX功能,糾正SERCA2、NCX、 p-PLB、PLB、p-Akt和p-PKCβ2表達(dá)。但是法舒地爾對糖尿病引起的心肌細(xì)胞鈣瞬變幅度的下降和肌漿網(wǎng)鈣儲備的減少無明顯改善。結(jié)論法舒地爾通過抑制RhoA/ROCK活性,對糖尿病大鼠心臟組織具有保護(hù)作用。其對于舒張功能的改善可能是通過調(diào)節(jié)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)及活性,從而加快胞漿內(nèi)鈣離子清除而實(shí)現(xiàn)的。第二部分Rho激酶抑制劑法舒地爾對糖尿病大鼠心臟肌動蛋白重構(gòu)的影響目的探討法舒地爾在糖尿病心臟組織肌動蛋白構(gòu)型變化中的作用方法雄性8周齡Sprague-Dawley大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素70mg/kg,建立1型糖尿病動物模型,正常對照組腹腔注射等量的枸櫞酸鈉。造模1周后,將糖尿病大鼠按照血糖和體重配對,隨機(jī)分為2組,法舒地爾干預(yù)組(1 Omg/kg/d)和糖尿病組。8周后,取心臟標(biāo)本,冰凍切片行鬼筆環(huán)肽染色,激光共聚焦顯微鏡觀察F-actin排列情況。超速離心法分離G-actin和F-actin。石蠟包埋切片行masson染色,評估左心室纖維化水平。Western blotting半定量分析肌動蛋白構(gòu)型變化和α-SMA表達(dá)變化。結(jié)果與正常對照組比較,糖尿病組大鼠心臟組織中F-actin排列紊亂,G-actin/F-actin比值下降,心臟間質(zhì)纖維化明顯,a-SMA表達(dá)增高。法舒地爾干預(yù)后,能有效恢復(fù)糖尿病心臟組織中F-actin排列,糾正G-actin/F-actin比值,抑制心肌間質(zhì)纖維化和α-SMA表達(dá)。結(jié)論法舒地爾能夠有效恢復(fù)糖尿病心臟組織中F-actin排列,改善肌動蛋白構(gòu)型變化,抑制心肌間質(zhì)纖維化,這可能是其改善糖尿病心肌病收縮與舒張功能障礙的部分機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R54

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本文編號：1706962