本文選題：線粒體自噬　切入點(diǎn)：焦亡　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：背景及目的:細(xì)胞焦亡是一種依賴半胱天冬氨酸蛋白酶-1(Cysteine aspartate-specific protease-1,caspase-1)活化的高炎癥性細(xì)胞死亡形式,氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡,在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展期不穩(wěn)定斑塊形成中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞自噬是細(xì)胞利用膜結(jié)構(gòu)將需要降解的細(xì)胞器或蛋白等進(jìn)行包裹形成自噬體,隨后與溶酶體結(jié)合將其降解。缺乏自噬會(huì)導(dǎo)致活性氧簇ROS的產(chǎn)生及NLRP3炎癥小體的活化,引起caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。BNIP3基因家族是一個(gè)獨(dú)特的Bcl-2家族BH3-only家族成員,包括BNIP3,NIX(也叫BNIP3L基因)。NIX定位于線粒體外膜,可與自噬相關(guān)蛋白(LC3和GABARAP等)結(jié)合,誘導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生并降解清除多余的線粒體。NIX介導(dǎo)的線粒體自噬途徑在哺乳細(xì)胞對(duì)損傷線粒體的降解中也發(fā)揮關(guān)鍵作用。我們前期研究表明ox-LDL作用于巨噬細(xì)胞后,對(duì)巨噬細(xì)胞自噬及細(xì)胞焦亡都產(chǎn)生影響。同時(shí),隨著ox-LDL的作用濃度增加,NIX的表達(dá)也隨之增多。表明NIX對(duì)巨噬細(xì)胞線粒體自噬有一定的調(diào)控作用。但NIX介導(dǎo)的線粒體自噬對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡的影響及機(jī)制目前尚不清楚。方法:1、ox-LDL作用于巨噬細(xì)胞J774A.1,通過RT-PCR檢測NIX mRNA表達(dá)水平;western-blot檢測NIX蛋白的表達(dá)情況,篩選合適的ox-LDL作用濃度和時(shí)間。2、采用western-blot檢測ox-LDL作用后LC3-Ⅱ/Ⅰ及NIX的表達(dá)情況。線粒體自噬的檢測用激光共聚焦觀察LC3、NIX、線粒體共定位的情況;采用小干擾RNA沉默NIX表達(dá)觀察對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)線粒體自噬的影響;3、細(xì)胞焦亡的檢測。采用LDH釋放試劑盒檢測LDH的釋放,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞AO/EB的染色情況,western-blot檢測caspase-1 p10、IL-1β的表達(dá)情況;以及沉默NIX表達(dá)后對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡的影響;4、采用DCFH-DA染色流式細(xì)胞儀檢測ox-LDL作用前后細(xì)胞內(nèi)ROS的水平;采用western-blot檢測NLRP3炎癥小體的表達(dá)情況,以及沉默NIX表達(dá)后對(duì)ROS的水平和NLRP3活化的影響;結(jié)果:1、本研究顯示ox-LDL處理巨噬細(xì)胞J774A.1后,NIX mRNA和蛋白的表達(dá)水平隨著ox-LDL作用濃度的增高相應(yīng)增加,并在100μg/ml增加幅度最大;在確定100μg/ml ox-LDL作用后隨著時(shí)間的增加,檢測NIX的表達(dá)情況也相應(yīng)增加,其中6小時(shí)的增幅最高。2、ox-LDL作用于巨噬細(xì)胞J774A.1后,Western-blot結(jié)果表明LC3-П/Ⅰ的表達(dá)增多;激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果表明NIX、自噬體LC3、線粒體三者存在共定位關(guān)系;運(yùn)用si RNA干擾技術(shù)靶向沉默NIX,抑制NIX的功能后,自噬通路中的自噬體LC3蛋白表達(dá)水平均較正常組減少。3、沉默NIX后,應(yīng)用ox-LDL作用于巨噬細(xì)胞中,結(jié)果發(fā)現(xiàn),LDH的釋放和AO/EB染色陽性細(xì)胞所占百分比較正常組顯著升高;caspase-1 p10和IL-1β蛋白的表達(dá)呈增高的趨勢。4、沉默NIX后,應(yīng)用ox-LDL作用于巨噬細(xì)胞中,ROS水平增加(90.5±0.48)%大于J774A.1組(69.3±0.75)%。NLRP3炎癥小體的表達(dá)情況增多;結(jié)論:ox-LDL可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡;NIX可能通過介導(dǎo)巨噬細(xì)胞線粒體自噬,從而降低細(xì)胞內(nèi)ROS的水平及NLRP3炎癥小體的活化,對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡發(fā)揮抑制作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R543.5

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本文編號(hào)：1702120