NIX介導的線粒體自噬對ox-LDL誘導巨噬細胞焦亡(pyroptosis)的影響
本文選題:線粒體自噬 切入點:焦亡 出處:《安徽醫(yī)科大學》2017年碩士論文
【摘要】:背景及目的:細胞焦亡是一種依賴半胱天冬氨酸蛋白酶-1(Cysteine aspartate-specific protease-1,caspase-1)活化的高炎癥性細胞死亡形式,氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)可誘導巨噬細胞發(fā)生caspase-1介導的細胞焦亡,在動脈粥樣硬化進展期不穩(wěn)定斑塊形成中發(fā)揮重要作用。細胞自噬是細胞利用膜結構將需要降解的細胞器或蛋白等進行包裹形成自噬體,隨后與溶酶體結合將其降解。缺乏自噬會導致活性氧簇ROS的產生及NLRP3炎癥小體的活化,引起caspase-1介導的細胞焦亡。BNIP3基因家族是一個獨特的Bcl-2家族BH3-only家族成員,包括BNIP3,NIX(也叫BNIP3L基因)。NIX定位于線粒體外膜,可與自噬相關蛋白(LC3和GABARAP等)結合,誘導線粒體自噬發(fā)生并降解清除多余的線粒體。NIX介導的線粒體自噬途徑在哺乳細胞對損傷線粒體的降解中也發(fā)揮關鍵作用。我們前期研究表明ox-LDL作用于巨噬細胞后,對巨噬細胞自噬及細胞焦亡都產生影響。同時,隨著ox-LDL的作用濃度增加,NIX的表達也隨之增多。表明NIX對巨噬細胞線粒體自噬有一定的調控作用。但NIX介導的線粒體自噬對ox-LDL誘導巨噬細胞焦亡的影響及機制目前尚不清楚。方法:1、ox-LDL作用于巨噬細胞J774A.1,通過RT-PCR檢測NIX mRNA表達水平;western-blot檢測NIX蛋白的表達情況,篩選合適的ox-LDL作用濃度和時間。2、采用western-blot檢測ox-LDL作用后LC3-Ⅱ/Ⅰ及NIX的表達情況。線粒體自噬的檢測用激光共聚焦觀察LC3、NIX、線粒體共定位的情況;采用小干擾RNA沉默NIX表達觀察對ox-LDL誘導線粒體自噬的影響;3、細胞焦亡的檢測。采用LDH釋放試劑盒檢測LDH的釋放,熒光顯微鏡觀察細胞AO/EB的染色情況,western-blot檢測caspase-1 p10、IL-1β的表達情況;以及沉默NIX表達后對ox-LDL誘導巨噬細胞焦亡的影響;4、采用DCFH-DA染色流式細胞儀檢測ox-LDL作用前后細胞內ROS的水平;采用western-blot檢測NLRP3炎癥小體的表達情況,以及沉默NIX表達后對ROS的水平和NLRP3活化的影響;結果:1、本研究顯示ox-LDL處理巨噬細胞J774A.1后,NIX mRNA和蛋白的表達水平隨著ox-LDL作用濃度的增高相應增加,并在100μg/ml增加幅度最大;在確定100μg/ml ox-LDL作用后隨著時間的增加,檢測NIX的表達情況也相應增加,其中6小時的增幅最高。2、ox-LDL作用于巨噬細胞J774A.1后,Western-blot結果表明LC3-П/Ⅰ的表達增多;激光共聚焦顯微鏡檢測結果表明NIX、自噬體LC3、線粒體三者存在共定位關系;運用si RNA干擾技術靶向沉默NIX,抑制NIX的功能后,自噬通路中的自噬體LC3蛋白表達水平均較正常組減少。3、沉默NIX后,應用ox-LDL作用于巨噬細胞中,結果發(fā)現(xiàn),LDH的釋放和AO/EB染色陽性細胞所占百分比較正常組顯著升高;caspase-1 p10和IL-1β蛋白的表達呈增高的趨勢。4、沉默NIX后,應用ox-LDL作用于巨噬細胞中,ROS水平增加(90.5±0.48)%大于J774A.1組(69.3±0.75)%。NLRP3炎癥小體的表達情況增多;結論:ox-LDL可誘導巨噬細胞發(fā)生caspase-1介導的細胞焦亡;NIX可能通過介導巨噬細胞線粒體自噬,從而降低細胞內ROS的水平及NLRP3炎癥小體的活化,對ox-LDL誘導的巨噬細胞焦亡發(fā)揮抑制作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】:安徽醫(yī)科大學
【學位級別】:碩士
【學位授予年份】:2017
【分類號】:R543.5
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,本文編號:1702120
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