本文選題：環(huán)指蛋白RNF6　切入點：啟動子　出處：《蘇州大學》2015年博士論文

【摘要】：第一部分RNF6在惡性血液腫瘤中功能的初步分析目的:目前,環(huán)指蛋白RNF6在惡性血液腫瘤中的功能及其分子機制尚未報道。本項目首先檢測了RNF6在多發(fā)性骨髓瘤和白血病病人樣本以及細胞株中的表達情況,并利用慢病毒過表達系統(tǒng)和sh RNA干擾技術分析RNF6在多發(fā)性骨髓瘤和白血病細胞中的作用,以期闡述RNF6在惡性血液腫瘤中的相關功能。(1)通過q-RT-PCR和RT-PCR方法檢測了病人樣本以及正常骨髓(NBM)樣本中RNF6的m RNA表達水平;(2)利用Immunoblotting技術檢測了RNF6在6種多發(fā)性骨髓瘤細胞株(H929、KMS11、LP1、OCI-My5、OPM2和RPMI-8226)以及7種白血病細胞株(AML2、HL60、NB4、THP1、K562、Jurkat和697)中的表達豐度;(3)通過生長曲線和集落形成實驗檢測過表達RNF6對白血病細胞增殖以及集落形成能力的影響;(4)利用sh RNA干擾技術檢測沉默RNF6對白血病細胞增殖的影響;(5)通過臺盼藍染色計數(shù)法檢測白血病細胞中過表達RNF6對硼替佐米敏感性的影響。結果：(1)采用q-RT-PCR和RT-PCR對病人樣本和正常骨髓樣本中RNF6的表達進行分析,發(fā)現(xiàn)RNF6的m RNA水平在惡性血液病病人樣本中存在高表達;(2)與正常骨髓樣本相比,RNF6在多發(fā)性骨髓瘤和白血病細胞株中蛋白質水平比較高;(3)生長曲線和集落生成實驗表明,過表達RNF6能夠顯著促進白血病細胞生長和集落形成能力;(4)sh RNA沉默RNF6能夠明顯抑制白血病細胞的生長;(5)利用慢病毒介導RNF6,使之在白血病細胞中高表達,可以顯著減弱K562對硼替佐米的藥物敏感性。小結：RNF6在多種多發(fā)性骨髓瘤和白血病的病人樣本和細胞株中均存在異常高表達。同時,過表達或者沉默RNF6以后,都能顯著地促進或者抑制癌細胞增殖。以上這些結果表明,RNF6可能與惡性血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。另外,過表達RNF6可以減弱K562細胞對硼替佐米的藥物敏感性,這提示,RNF6還可能與癌細胞的耐藥性相關。第二部分5AHQ對RNF6的轉錄調控機制分析目的:已有研究發(fā)現(xiàn),喹啉類似物5AHQ具有很強的抗多發(fā)性骨髓瘤和抗白血病活性。同時,前期通過DNA Microarray發(fā)現(xiàn),5AHQ可以顯著影響RNF6的m RNA水平。本項目將進一步闡述RNF6的轉錄調控機制,從而進一步揭示5AHQ抗腫瘤的相關分子機制。(1)多發(fā)性骨髓瘤和白血病細胞株經(jīng)5AHQ加藥處理24小時后,利用MTT法檢測藥物的細胞毒活性;(2)5AHQ分別處理多發(fā)性骨髓瘤細胞株(OCI-My5和RPMI-8226)和白血病細胞株(AML2和K562)24小時后,提取細胞總蛋白和總RNA,分別經(jīng)Immunoblotting或者RT-PCR檢測RNF6的蛋白或m RNA水平;(3)UCSC網(wǎng)站預測RNF6的啟動子序列,并構建RNF6的啟動子截斷體,然后利用熒光素酶雙基因報告系統(tǒng)檢測RNF6啟動子截斷體的熒光素酶活性;(4)利用TFSearch軟件預測RNF6核心啟動子上可能的轉錄因子結合位點,并對其進行點突變和缺失突變,檢測預測位點對啟動子活性的影響;(5)利用CHIP實驗檢測Pbx1與RNF6啟動子區(qū)域的結合情況;(6)利用熒光素酶雙基因報告系統(tǒng)檢測Pbx1/Prep1/MEIS1對RNF6啟動子活性的影響;(7)利用Co-IP檢測5AHQ對Pbx1/Prep1異源二聚體形成的影響;同時利用熒光素酶雙基因報告系統(tǒng)檢測5AHQ對RNF6核心啟動子活性的影響。結果：(1)MTT結果顯示,5AHQ能夠顯著抑制多發(fā)性骨髓瘤和白血病細胞的存活;(2)5AHQ分別處理骨髓瘤和白血病細胞株后,RNF6的m RNA和蛋白水平均顯著下調,這說明5AHQ可以下調RNF6的轉錄并抑制其蛋白的表達;(3)通過缺失突變分析發(fā)現(xiàn),-365/-99是RNF6的核心啟動子區(qū)域,具有較強的轉錄活性;(4)利用定點突變和缺失突變技術發(fā)現(xiàn),RNF6核心啟動子區(qū)域中的Pbx1結合位點能夠顯著調控RNF6的啟動子活性;(5)CHIP實驗結果顯示,Pbx1可以和RNF6啟動子區(qū)域結合;(6)當單轉染Pbx1時,并不能顯著上調RNF6的啟動子活性,而當Pbx1與Prep1共轉染后發(fā)現(xiàn),可以顯著上調RNF6的啟動子活性,這說明,Pbx1需要形成異源二聚體后才能調控RNF6的轉錄;(7)5AHQ可以顯著抑制Pbx1/Prep1異源二聚體的形成,以及明顯下調RNF6核心啟動子的活性。小結：進一步證實了5AHQ可以顯著抑制骨髓瘤和白血病細胞存活,并且可以通過抑制Pbx1/Prep1異源二聚體的形成來調控RNF6的轉錄表達。其中也發(fā)現(xiàn),-365/-99為RNF6的核心啟動子,Pbx1轉錄因子可以介導RNF6的轉錄。第三部分RNF6泛素化特點的分析目的:RNF6屬于環(huán)指蛋白家族,環(huán)指蛋白家族成員一般都可以發(fā)生自身泛素化。本部分將考察RNF6的泛素化情況并尋找其特異性泛素化位點,從而進一步揭示RNF6的泛素化機制。(1)分別加入溶酶體抑制劑(NH4Cl和Chloroquine)以及蛋白酶體抑制劑(MG132和Lactacystin)考察RNF6通過何種方式發(fā)生降解;(2)利用免疫共沉淀方法(Co-IP)檢測RNF6的泛素化情況;(3)通過定點突變技術(Lysine突變成Arginine)構建RNF6一系列單點突變體、三點突變體和四點突變體,然后通過MG132處理分析這些突變體的泛素化降解情況;(4)通過CHX Chase實驗檢測WT,K0,K608和K608R蛋白的半衰期;(5)通過轉染一系列不同的去泛素化酶,檢測RNF6的去泛素化情況。結果：(1)蛋白酶體抑制劑MG132和Lactacystin能夠顯著聚集RNF6蛋白,而溶酶體抑制劑NH4Cl和Chloroquine并不能影響RNF6蛋白量,這提示RNF6主要通過蛋白酶體途徑進行降解;(2)通過Co-IP實驗發(fā)現(xiàn),RNF6蛋白能夠形成顯著的多聚泛素鏈,同時加入蛋白酶體抑制劑后,RNF6蛋白的多聚泛素鏈明顯增多,這說明RNF6蛋白能夠發(fā)生多聚泛素化;(3)通過點突變分析發(fā)現(xiàn),RNF6中第608位賴氨酸位點發(fā)生突變后,能夠明顯阻斷RNF6的泛素-蛋白酶體降解,表明K608為RNF6的重要泛素化位點。但是K0(Lysine-free)依然能夠發(fā)生一定程度的泛素化,這說明除了賴氨酸位點外,可能還存在其它的氨基酸位點介導RNF6的泛素化,如半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等;(4)CHX Chase實驗表明,K608R顯著延長了RNF6蛋白的半衰期;(5)通過共轉染一系列去泛素化酶質粒發(fā)現(xiàn),某些DUBs可以明顯上調RNF6的表達水平,其中USP22得到了進一步的論證。小結：環(huán)指蛋白RNF6主要通過泛素-蛋白酶體途徑進行降解。同時,RNF6能夠發(fā)生多聚泛素化,其中K608為RNF6的重要泛素化位點。另外通過去泛素化酶篩選發(fā)現(xiàn),USP22可能為RNF6的去泛素化酶。第四部分RNF6促進GR的泛素化并增強其穩(wěn)定性目的:近期有研究發(fā)現(xiàn),RNF6作為E3(泛素連接酶)可以介導雄激素受體AR發(fā)生非典型泛素化而促進前列腺癌細胞生長。但在血液病細胞中的機制還不清楚。據(jù)此,本項目將探索RNF6是否能夠影響多發(fā)性骨髓瘤細胞中糖皮質激素受體GR的相關功能,從而更進一步闡述RNF6在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。方法：(1)通過Immunoblotting檢測骨髓瘤和白血病細胞株中GR和RNF6的蛋白表達豐度,并檢測骨髓瘤細胞經(jīng)5AHQ處理后GR和RNF6的蛋白表達趨勢;(2)通過質粒共轉染方法研究RNF6對GR蛋白表達的影響;(3)CHX chase實驗考察RNF6對GR蛋白半衰期的影響;(4)Co-IP分析RNF6與GR是否存在相互作用;(5)利用缺失突變技術構建一系列RNF6與GR的截斷體,再通過Co-IP實驗分析RNF6與GR在哪一區(qū)域發(fā)生相互作用;(6)通過Co-IP分析RNF6能否介導GR發(fā)生泛素化;(7)使用地塞米松(Dex)或MG132處理分析RNF6對Dex誘導的GR降解的影響。結果：(1)RNF6和GR的蛋白表達豐度基本一致,而且不同骨髓瘤細胞經(jīng)5AHQ處理后發(fā)現(xiàn),GR和RNF6蛋白表達趨勢一致,這暗示RNF6與GR可能存在一定的關聯(lián)性;(2)RNF6能夠上調外源性和內源性GR蛋白水平,而GR的m RNA水平并沒有發(fā)生變化,這提示RNF6通過影響GR的翻譯后修飾上調GR蛋白水平;(3)通過CHX chase實驗發(fā)現(xiàn),RNF6能夠延長GR蛋白的半衰期;(4)Co-IP實驗發(fā)現(xiàn),RNF6與GR存在相互作用關系;(5)缺失突變分析發(fā)現(xiàn),GR蛋白的531-777區(qū)域與RNF6發(fā)生結合,RNF6蛋白的87-482區(qū)域與GR發(fā)生結合;(6)通過Co-IP實驗發(fā)現(xiàn),RNF6能夠促進GR發(fā)生非降解型的多聚泛素化,即非典型泛素化;(7)RNF6能夠抑制Dex介導的GR蛋白降解。小結：RNF6與GR存在相互作用,并且RNF6結合在GR的LBD結構域區(qū)域。另外,RNF6作為E3泛素連接酶,能夠促進GR發(fā)生非典型泛素化而導致其發(fā)生穩(wěn)定。同時,RNF6能夠抑制地塞米松所誘導的GR的降解。結論本研究首先分析了RNF6在多發(fā)性骨髓瘤和白血病病人樣本和細胞株中的表達情況,發(fā)現(xiàn)RNF6存在高表達。另外,通過慢病毒過表達和干擾系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn),RNF6方法:能夠影響K562細胞的增殖以及對硼替佐米的敏感性,以上這些結果表明RNF6可能與惡性血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。同時發(fā)現(xiàn),抗血液腫瘤化合物5AHQ能夠影響RNF6的轉錄。進一步對RNF6的啟動子區(qū)域分析發(fā)現(xiàn),-365/-99為RNF6的核心啟動子區(qū)域,同時轉錄因子Pbx1與TALE家族蛋白如Prep1等形成異源二聚體后,能夠調控RNF6的轉錄表達。而且,5AHQ可以通過抑制Pbx1與Prep1的異源二聚化,從而抑制RNF6啟動子的活化。另外,由于RNF6為環(huán)指家族蛋白,能夠發(fā)生自身泛素化,并主要通過泛素-蛋白酶體途徑進行降解。同時也對RNF6的泛素化位點進行了分析,發(fā)現(xiàn)RNF6中的賴氨酸位點K608發(fā)生突變后,可以顯著抑制RNF6的泛素化降解,這提示K608為RNF6的重要泛素化位點。然而,K0(Lysine-free)仍然能夠發(fā)生一定程度的泛素化,這表明除了賴氨酸位點外,還存在其它泛素化位點介導RNF6的泛素化,如半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等。另外,通過探索RNF6與多發(fā)性骨髓瘤中GR的關系發(fā)現(xiàn),RNF6與GR能夠發(fā)生結合,并且RNF6結合在GR的LBD結構域區(qū)域。另外,作為E3泛素連接酶的RNF6能夠誘導GR發(fā)生非典型泛素化而增強其穩(wěn)定性。同時,RNF6能夠阻斷地塞米松所誘導的GR的降解。這些結果表明,RNF6可能與GC/GR信號通路相關。總之,本項目首次報道了RNF6在惡性血液腫瘤(尤其是多發(fā)性骨髓瘤和白血病)中的相關功能及其分子機制,相信能為以后開發(fā)以RNF6為靶點的藥物奠定基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R733

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本文編號：1654299