本文選題：mi　切入點：R-199a-5p　出處：《第三軍醫(yī)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景與研究目的:慢性低氧是紫紺型先天性心臟病(cyanotic congenital heart defect,CCHD)患者的主要病理生理特征之一,同時也見于一些慢性缺血缺氧性心臟病。在長期的低氧條件下,心肌組織可以對低氧環(huán)境產(chǎn)生適應,從而維持心肌細胞存活,確保心臟的功能,患者往往可以存活數(shù)年甚至更長時間,而不發(fā)生心力衰竭。探明心肌細胞對慢性低氧適應的機制,對于CCHD及缺血缺氧性心臟病的診斷、治療尤其是CCHD患兒圍手術期針對性的心肌保護具有重要的臨床意義,但目前對此機制了解尚不完全。本科室既往研究發(fā)現(xiàn)CCHD患兒心肌細胞在慢性缺氧后引發(fā)內(nèi)質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS),激活活化轉錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)信號途徑的未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR),使內(nèi)質網(wǎng)應激壓力得以緩解,避免心肌細胞損傷和凋亡,起到保護心肌細胞的重要作用。另一方面,本課題組過去研究發(fā)現(xiàn)紫紺型先心病心肌組織在缺氧時激活炎癥免疫反應導致STAT3信號活化,參與了對心肌細胞的保護作用。本課題在前期研究基礎上,圍繞miR-199a-5p,及其潛在的靶基因,ATF6和78-kD葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(78-kD glucose-regulated protein,GRP78)在心肌慢性缺氧時可能的調(diào)控作用開展了深入研究,同時,對缺氧時炎癥免疫機制引起STAT3活化這一重要信號通路是否參與促進了miR-199a-5p的表達下調(diào),也進行了研究探索。研究方法與內(nèi)容:第一部分收集紫紺型先天性心臟病與非紫紺型先天性心臟病(Acyanotic congenital heart defects,ACHD)臨床患者手術中切除的心肌組織,分析ATF6(p50與p90片段)、GRP78的蛋白與mRNA表達情況,檢測心肌組織miR-199a-5p的水平,并進行其與心肌ATF6與GRP78表達水平,以及患者血氧飽和度之間的相關性分析。第二部分利用低氧培養(yǎng)的人心肌細胞株(Human Cardiac Myocyte,HCM)作為研究模型,進行常氧與低氧培養(yǎng),通過microRNA模擬物miR-199a-5p mimic與抑制物mi R-199a-5p inhibitor轉染干預細胞中mi R-199a-5p的水平后,檢測ATF6、GRP78的蛋白與mRNA表達,應用流式細胞儀技術檢測Annexin V陽性的細胞凋亡率并觀察ERS凋亡相關蛋白chop的表達情況,應用雙熒光素報告載體實驗研究在hek293t細胞及常氧和低氧培養(yǎng)的hcm細胞中,mir-199a-5p對atf6和grp78的3'-utr區(qū)的靶向作用情況。第三部分檢測cchd與achd患兒心肌組織中白介素(interleukin,il)-6和il-11的表達及stat3磷酸化情況。將balb/c小鼠在相當于正常大氣50%氧含量條件下的低壓低氧艙中暴露7天和21天,同時腹腔注射s3i-201干預stat3信號的激活,檢測對mir-199a-5p水平及其前體原始microrna即pri-mir-199a-1和pri-mir-199a-2表達的影響。利用染色質免疫共沉淀(chip)技術,研究pstat3與pri-mir-199a啟動子區(qū)的作用情況。此外,還觀察了缺氧小鼠注射s3i-201干預stat3活化后,以及同時注射mir-199a-5pantagomir抑制mir-199a-5p的水平對心肌中mir-199a-5p靶基因atf6與grp78的表達及細胞凋亡的影響。研究結果:1.cchd患者心肌組織中mir-199a-5p與grp78、atf6的表達存在相關性利用手術中收集的心臟組織標本,發(fā)現(xiàn)cchd患者心肌組織中mir-199a-5p的水平顯著低于achd患者,低氧后mir-199a-5p的降低與患者血氧飽和度的降低存在顯著的正相關性。cchd患者心肌組織中atf6、grp78的mrna和蛋白表達水平相對achd較高。同時,cchd患兒心肌組織中mir-199a-5p的水平與atf6、grp78的表達水平存在顯著的負相關性。2.低氧培養(yǎng)的心肌細胞中mir-199a-5p下調(diào)可促進grp78和atf6的表達通過建立人心肌細胞(hcm)的不同氧濃度(3%o2和1%o2)低氧培養(yǎng)模型,我們發(fā)現(xiàn)與常氧培養(yǎng)相比,中度低氧(3%o2)培養(yǎng)的hcm細胞atf6、grp78表達增加,upr增強,細胞未發(fā)生明顯的凋亡反應,最接近cchd患兒慢性低氧后能生存及心肌細胞未嚴重受損的實際情況。而1%o2培養(yǎng)的hcm細胞雖然atf6、grp78表達也增加,但細胞出現(xiàn)了較嚴重的凋亡,因此在3%o2條件下培養(yǎng)hcm細胞被作為我們模擬cchd心肌細胞的體外研究模型。與常氧相比,持續(xù)的中度低氧(3%o2)可以導致心肌細胞mir-199a-5p水平數(shù)倍的降低。當將mir-199a-5pmimic轉染至3%o2低氧培養(yǎng)的hcm中,則atf6和grp78的表達水平顯著降低,內(nèi)質網(wǎng)應激相關凋亡分子chop的表達和annexinv+細胞凋亡率顯著增高,而mir-199a-5pinhibitor轉染可導致缺氧hcm細胞atf6和grp78表達進一步增強和凋亡率進一步降低。上述結果提示心肌細胞低氧時mir-199a-5p的下調(diào)對atf6和grp78的表達具有顯著的促進作用。我們通過構建含有atf6和grp78mrna3'-utr區(qū)mir-199a-5p潛在結合位點(野生型和突變型)序列的雙熒光素報告載體,與mir-199a-5pmimic一起轉染進hek293t細胞和hcm細胞,通過熒光素檢測證明了mir-199a-5p對atf6和grp78的3'-utr區(qū)具有直接的靶向結合作用,且在hcm心肌細胞中這種靶向調(diào)控作用相比于hek293t細胞具有一定的組織細胞性優(yōu)勢。另外,通過雙熒光素報告載體實驗也證明,hcm細胞低氧培養(yǎng)時,由于內(nèi)源性mir-199a-5p的水平降低,會導致mir-199a-5pmimic對atf6和grp78的3'-utr區(qū)的靶向作用減弱。3.低氧時心肌細胞stat3信號的活化促進了mir-199a-5p的水平下調(diào)與非紫紺組相比,紫紺型先心病組心肌組織中pstat3/stat3表達比值顯著增高,顯示stat3信號活化。同時,紫紺型先心病患兒心肌組織勻漿中il-6、il-11的表達水平顯著高于非紫紺組,提示低氧通過誘導il-6、il-11等因子的生成激活心肌細胞stat3信號。相關性分析發(fā)現(xiàn)cchd患者心肌il-6、il-11的水平與mir-199a-5p的水平呈顯著的負相關性。小鼠低氧暴露7天和21天時mir-199a-5p的水平相比常氧小鼠出現(xiàn)數(shù)倍的降低,qrt-pcr檢測發(fā)現(xiàn)低氧導致mir-199a-5p的降低主要與其前體原始microrna分子pri-mir-199a-2(而非pri-mir-199a-1)的表達降低有關。若小鼠在接受低氧處理同時腹腔注射stat3特異性抑制劑s3i-201,則mir-199a-5p和pri-mir-199a-2的降低被顯著阻礙。利用常氧與低氧下小鼠的心肌組織進行chip實驗證實,pstat3可以與pri-mir-199a-2的啟動子區(qū)進行結合,且低氧時這種結合性顯著增強。小鼠低氧后導致心肌組織atf6和grp78的表達增高,但注射s3i-201干預stat3信號后,在mir-199a-5p的水平下降被抑制的同時,mir-199a-5p靶基因atf6和grp78的表達增高也被抑制,內(nèi)質網(wǎng)應激相關凋亡蛋白chop的表達增高,提示細胞凋亡增多。另外,在干預stat3信號同時如果同時給予mir-199a-5pantagomir注射抑制mir-199a-5p的水平,則atf6和grp78的表達相對于單獨干預stat3時增強,凋亡分子chop的表達可相對被抑制。結論綜合本研究結果,cchd患者心肌細胞在長期低氧作用下,尤其是在低氧導致的心肌細胞炎癥免疫機制激活引起stat3信號活化的情況下,mir-199a-5p的表達水平會顯著降低,導致其靶基因atf6和grp78表達水平增高,促進未折疊蛋白反應增強,減緩缺氧引起的細胞內(nèi)質網(wǎng)應激壓力,對低氧環(huán)境下的心肌細胞起到保護作用,避免其損傷和凋亡,這有利于心肌組織對慢性低氧環(huán)境的適應。因此,mir-199a-5p有望成為對紫紺型先心病,以及其它慢性缺血缺氧性心臟疾病患者進行診斷、治療、藥物開發(fā)和CCHD圍手術期心肌保護的有效靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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