本文選題：mi　切入點(diǎn)：R-199a-5p　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景與研究目的:慢性低氧是紫紺型先天性心臟病(cyanotic congenital heart defect,CCHD)患者的主要病理生理特征之一,同時(shí)也見于一些慢性缺血缺氧性心臟病。在長期的低氧條件下,心肌組織可以對(duì)低氧環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng),從而維持心肌細(xì)胞存活,確保心臟的功能,患者往往可以存活數(shù)年甚至更長時(shí)間,而不發(fā)生心力衰竭。探明心肌細(xì)胞對(duì)慢性低氧適應(yīng)的機(jī)制,對(duì)于CCHD及缺血缺氧性心臟病的診斷、治療尤其是CCHD患兒圍手術(shù)期針對(duì)性的心肌保護(hù)具有重要的臨床意義,但目前對(duì)此機(jī)制了解尚不完全。本科室既往研究發(fā)現(xiàn)CCHD患兒心肌細(xì)胞在慢性缺氧后引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS),激活活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)信號(hào)途徑的未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR),使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激壓力得以緩解,避免心肌細(xì)胞損傷和凋亡,起到保護(hù)心肌細(xì)胞的重要作用。另一方面,本課題組過去研究發(fā)現(xiàn)紫紺型先心病心肌組織在缺氧時(shí)激活炎癥免疫反應(yīng)導(dǎo)致STAT3信號(hào)活化,參與了對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。本課題在前期研究基礎(chǔ)上,圍繞miR-199a-5p,及其潛在的靶基因,ATF6和78-kD葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(78-kD glucose-regulated protein,GRP78)在心肌慢性缺氧時(shí)可能的調(diào)控作用開展了深入研究,同時(shí),對(duì)缺氧時(shí)炎癥免疫機(jī)制引起STAT3活化這一重要信號(hào)通路是否參與促進(jìn)了miR-199a-5p的表達(dá)下調(diào),也進(jìn)行了研究探索。研究方法與內(nèi)容:第一部分收集紫紺型先天性心臟病與非紫紺型先天性心臟病(Acyanotic congenital heart defects,ACHD)臨床患者手術(shù)中切除的心肌組織,分析ATF6(p50與p90片段)、GRP78的蛋白與mRNA表達(dá)情況,檢測(cè)心肌組織miR-199a-5p的水平,并進(jìn)行其與心肌ATF6與GRP78表達(dá)水平,以及患者血氧飽和度之間的相關(guān)性分析。第二部分利用低氧培養(yǎng)的人心肌細(xì)胞株(Human Cardiac Myocyte,HCM)作為研究模型,進(jìn)行常氧與低氧培養(yǎng),通過microRNA模擬物miR-199a-5p mimic與抑制物mi R-199a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染干預(yù)細(xì)胞中mi R-199a-5p的水平后,檢測(cè)ATF6、GRP78的蛋白與mRNA表達(dá),應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)Annexin V陽性的細(xì)胞凋亡率并觀察ERS凋亡相關(guān)蛋白chop的表達(dá)情況,應(yīng)用雙熒光素報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)研究在hek293t細(xì)胞及常氧和低氧培養(yǎng)的hcm細(xì)胞中,mir-199a-5p對(duì)atf6和grp78的3'-utr區(qū)的靶向作用情況。第三部分檢測(cè)cchd與achd患兒心肌組織中白介素(interleukin,il)-6和il-11的表達(dá)及stat3磷酸化情況。將balb/c小鼠在相當(dāng)于正常大氣50%氧含量條件下的低壓低氧艙中暴露7天和21天,同時(shí)腹腔注射s3i-201干預(yù)stat3信號(hào)的激活,檢測(cè)對(duì)mir-199a-5p水平及其前體原始microrna即pri-mir-199a-1和pri-mir-199a-2表達(dá)的影響。利用染色質(zhì)免疫共沉淀(chip)技術(shù),研究pstat3與pri-mir-199a啟動(dòng)子區(qū)的作用情況。此外,還觀察了缺氧小鼠注射s3i-201干預(yù)stat3活化后,以及同時(shí)注射mir-199a-5pantagomir抑制mir-199a-5p的水平對(duì)心肌中mir-199a-5p靶基因atf6與grp78的表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響。研究結(jié)果:1.cchd患者心肌組織中mir-199a-5p與grp78、atf6的表達(dá)存在相關(guān)性利用手術(shù)中收集的心臟組織標(biāo)本,發(fā)現(xiàn)cchd患者心肌組織中mir-199a-5p的水平顯著低于achd患者,低氧后mir-199a-5p的降低與患者血氧飽和度的降低存在顯著的正相關(guān)性。cchd患者心肌組織中atf6、grp78的mrna和蛋白表達(dá)水平相對(duì)achd較高。同時(shí),cchd患兒心肌組織中mir-199a-5p的水平與atf6、grp78的表達(dá)水平存在顯著的負(fù)相關(guān)性。2.低氧培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中mir-199a-5p下調(diào)可促進(jìn)grp78和atf6的表達(dá)通過建立人心肌細(xì)胞(hcm)的不同氧濃度(3%o2和1%o2)低氧培養(yǎng)模型,我們發(fā)現(xiàn)與常氧培養(yǎng)相比,中度低氧(3%o2)培養(yǎng)的hcm細(xì)胞atf6、grp78表達(dá)增加,upr增強(qiáng),細(xì)胞未發(fā)生明顯的凋亡反應(yīng),最接近c(diǎn)chd患兒慢性低氧后能生存及心肌細(xì)胞未嚴(yán)重受損的實(shí)際情況。而1%o2培養(yǎng)的hcm細(xì)胞雖然atf6、grp78表達(dá)也增加,但細(xì)胞出現(xiàn)了較嚴(yán)重的凋亡,因此在3%o2條件下培養(yǎng)hcm細(xì)胞被作為我們模擬cchd心肌細(xì)胞的體外研究模型。與常氧相比,持續(xù)的中度低氧(3%o2)可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞mir-199a-5p水平數(shù)倍的降低。當(dāng)將mir-199a-5pmimic轉(zhuǎn)染至3%o2低氧培養(yǎng)的hcm中,則atf6和grp78的表達(dá)水平顯著降低,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡分子chop的表達(dá)和annexinv+細(xì)胞凋亡率顯著增高,而mir-199a-5pinhibitor轉(zhuǎn)染可導(dǎo)致缺氧hcm細(xì)胞atf6和grp78表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)和凋亡率進(jìn)一步降低。上述結(jié)果提示心肌細(xì)胞低氧時(shí)mir-199a-5p的下調(diào)對(duì)atf6和grp78的表達(dá)具有顯著的促進(jìn)作用。我們通過構(gòu)建含有atf6和grp78mrna3'-utr區(qū)mir-199a-5p潛在結(jié)合位點(diǎn)(野生型和突變型)序列的雙熒光素報(bào)告載體,與mir-199a-5pmimic一起轉(zhuǎn)染進(jìn)hek293t細(xì)胞和hcm細(xì)胞,通過熒光素檢測(cè)證明了mir-199a-5p對(duì)atf6和grp78的3'-utr區(qū)具有直接的靶向結(jié)合作用,且在hcm心肌細(xì)胞中這種靶向調(diào)控作用相比于hek293t細(xì)胞具有一定的組織細(xì)胞性優(yōu)勢(shì)。另外,通過雙熒光素報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)也證明,hcm細(xì)胞低氧培養(yǎng)時(shí),由于內(nèi)源性mir-199a-5p的水平降低,會(huì)導(dǎo)致mir-199a-5pmimic對(duì)atf6和grp78的3'-utr區(qū)的靶向作用減弱。3.低氧時(shí)心肌細(xì)胞stat3信號(hào)的活化促進(jìn)了mir-199a-5p的水平下調(diào)與非紫紺組相比,紫紺型先心病組心肌組織中pstat3/stat3表達(dá)比值顯著增高,顯示stat3信號(hào)活化。同時(shí),紫紺型先心病患兒心肌組織勻漿中il-6、il-11的表達(dá)水平顯著高于非紫紺組,提示低氧通過誘導(dǎo)il-6、il-11等因子的生成激活心肌細(xì)胞stat3信號(hào)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)cchd患者心肌il-6、il-11的水平與mir-199a-5p的水平呈顯著的負(fù)相關(guān)性。小鼠低氧暴露7天和21天時(shí)mir-199a-5p的水平相比常氧小鼠出現(xiàn)數(shù)倍的降低,qrt-pcr檢測(cè)發(fā)現(xiàn)低氧導(dǎo)致mir-199a-5p的降低主要與其前體原始microrna分子pri-mir-199a-2(而非pri-mir-199a-1)的表達(dá)降低有關(guān)。若小鼠在接受低氧處理同時(shí)腹腔注射stat3特異性抑制劑s3i-201,則mir-199a-5p和pri-mir-199a-2的降低被顯著阻礙。利用常氧與低氧下小鼠的心肌組織進(jìn)行chip實(shí)驗(yàn)證實(shí),pstat3可以與pri-mir-199a-2的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行結(jié)合,且低氧時(shí)這種結(jié)合性顯著增強(qiáng)。小鼠低氧后導(dǎo)致心肌組織atf6和grp78的表達(dá)增高,但注射s3i-201干預(yù)stat3信號(hào)后,在mir-199a-5p的水平下降被抑制的同時(shí),mir-199a-5p靶基因atf6和grp78的表達(dá)增高也被抑制,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白chop的表達(dá)增高,提示細(xì)胞凋亡增多。另外,在干預(yù)stat3信號(hào)同時(shí)如果同時(shí)給予mir-199a-5pantagomir注射抑制mir-199a-5p的水平,則atf6和grp78的表達(dá)相對(duì)于單獨(dú)干預(yù)stat3時(shí)增強(qiáng),凋亡分子chop的表達(dá)可相對(duì)被抑制。結(jié)論綜合本研究結(jié)果,cchd患者心肌細(xì)胞在長期低氧作用下,尤其是在低氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞炎癥免疫機(jī)制激活引起stat3信號(hào)活化的情況下,mir-199a-5p的表達(dá)水平會(huì)顯著降低,導(dǎo)致其靶基因atf6和grp78表達(dá)水平增高,促進(jìn)未折疊蛋白反應(yīng)增強(qiáng),減緩缺氧引起的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激壓力,對(duì)低氧環(huán)境下的心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用,避免其損傷和凋亡,這有利于心肌組織對(duì)慢性低氧環(huán)境的適應(yīng)。因此,mir-199a-5p有望成為對(duì)紫紺型先心病,以及其它慢性缺血缺氧性心臟疾病患者進(jìn)行診斷、治療、藥物開發(fā)和CCHD圍手術(shù)期心肌保護(hù)的有效靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：1646595