發(fā)布時間：2018-03-19 20:21

  本文選題：PDGFR抑制劑　切入點：血管平滑肌細胞　出處：《南京大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：前言藥物涂層支架(Drug eluting stent,DES)已用于冠狀動脈治療,但外周動脈中DES仍處于動物實驗和臨床試驗狀態(tài),支架內再狹窄(in-stent restenosis,ISR)和內皮化(re-endothelialization,RE)不全仍是亟需解決的問題。ISR和血管平滑肌增殖所致的內膜增生密切相關,RE不全是由于洗脫藥物非特異性的抗增殖的作用,這些藥物在抑制血管平滑肌增殖的同時,抑制了血管內皮細胞的生長。因而,有必要設計出新的藥物涂層支架,"靶向"抑制血管平滑肌增生的同時,不影響內皮細胞的生長。血小板生長因子(platelet derived growth factor,PDGF),包括 PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D是影響血管平滑肌生長重要的生長因子。PDGF受體(PDGF receptor,PDGFR)是廣泛表達于血管平滑肌細胞上的一種細胞因子受體,和平滑肌細胞的增殖和遷徙有密切的關系,但該受體在內皮細胞上卻無表達。其中PDGF-B可以結合所有表達在平滑肌細胞上的所有受體(PDGF-R α α,PDGF-Rαβ and PDGF-Rββ),導致PDGF-R的磷酸化,從而激活下游信號通路。因而通過抑制PDGFR的激活來抑制平滑肌增殖成為支架涂層藥物的新"靶點"。舒尼替尼(Sunitinib),是絡氨酸激酶受體的抑制劑,可明顯的抑制PDGF-R的磷酸化,而對VEGF-R、FGF-R和EGF-R的抑制效果微弱。目前Sunitinib主要用于胃間質腫瘤或腎母細胞瘤的靶向藥物,其作為支架洗脫藥物抑制內膜增生還未被研究。本研究擬合成一種新型藥物涂層支架(Sunitinib藥物涂層支架),通過體外實驗驗證該涂層藥物對血管平滑肌增殖和遷徙的效果,進而探討其作用的機制。然后體外合成該藥物涂層支架,體外檢測其載藥性質和血液相容性,最后將該藥物涂層支架植入至兔頸動脈內,通過影像學、形態(tài)學觀察和標本的分子生物學的檢測驗證該新型藥物涂層支架的有效性和安全性。第一部分:PDGFR抑制劑Sunitinib對血管平滑肌細胞增殖和遷徙作用的初步研究目的:體外實驗檢測藥物Sunitinib對血管平滑肌細胞增生和遷徙的影響,探討Sunitinib作用于平滑肌的分子生物學機制。方法:MTT實驗檢測藥物Sunitinib對大鼠血管平滑肌和內皮細胞的殺傷作用。Annexin V-FITC/PI染色檢測Sunitinib對大鼠血管平滑肌凋亡和壞死的影響。細胞劃痕實驗檢測Sunitinib對大鼠血管平滑肌遷徙的影響。免疫熒光檢測Sunitinib藥物作用后大鼠血管平滑肌α-actin熒光表達。Western Blot法檢測Sunitinib作用后平滑肌細胞內p-PDGFR和p-ERK的表達。結果:MTT實驗顯示Sunitinib可劑量依賴性的抑制血管平滑肌細胞的生長,但對血管內皮細胞的生長在濃度0.1、1μM時無明顯抑制作用。Annexin V-FITC/PI染色檢測提示Sunitinib是通過促進平滑肌細胞的凋亡和壞死來抑制增殖。細胞劃痕實驗檢測顯示Sunitinib可劑量依賴性的抑制平滑肌細胞的遷徙通過抑制平滑肌細胞中α-actin的表達。Western Blot結果顯示:Sunitinib可以通過抑制PDGF介導的p-ERK的激活來抑制平滑肌細胞的增殖和遷徙。結論:Sunitinib可特異性的抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷徙通過抑制PDGF介導的p-ERK的激活。第二部分:Sunitinib藥物涂層支架的構建和體外相容性的檢測目的:體外構建Sunitinib藥物涂層支架,檢測其載藥性質和血液相容性,觀察流體力學刺激對種植于支架表面內皮細胞的影響。方法:將金屬裸支架浸泡于含藥物Sunitinib濃度為2 mg/g聚乙二醇(PEG)凝膠中,構建Sunitinib藥物涂層支架,檢測其載藥劑量及球囊擴張對支架載藥量的影響。評價Sunitinib藥物涂層支架體外抗凝性質,通過血管平滑肌細胞粘附實驗體外觀察Sunitinib藥物涂層支架對平滑肌細胞的作用。檢測Sunitinib藥物涂層支架上血管內皮細胞生長情況,將Sunitinib藥物涂層支架放入生物反應器反應1、3、5周后,qPCR和Western bolt檢測流體力學刺激對種植于支架表面內皮細胞的影響。結果:每個支架所攜帶的Sunitinib的總量為32±5.4μg,球囊擴張前后支架上所攜帶的Sunitinib的總量未發(fā)生明顯的變化。通過電鏡觀察血小板粘附程度的實驗發(fā)現:所合成藥物涂層支架上未見血小板粘附,提示藥物涂層支架抗凝性能良好。檢測血管平滑肌細胞的粘附率發(fā)現,裸支架每個支架支柱可見21.8±9.3個細胞的粘附,而藥物涂層支架,每個支架支柱僅見11.2±5.4個細胞的粘附(21.8±9.3 versus11.2±5.4/支架支柱,p=0.03)。內皮細胞的生長的電鏡結果提示:內皮細胞在藥物涂層支架上生長良好,排列整齊,在裸支架上生長良好,但排列紊亂。當藥物涂層支架生物反應器反應一段時間后,eNOS的蛋白質和mRNA的表達都明顯的增高,且升高呈現時間依賴性,提示Sunitinib藥物涂層支架在流體環(huán)境中反應良好。結論:本實驗中體外構建的Sunitinib藥物涂層支架載藥性能良好,有優(yōu)良的血液相容性,在流體環(huán)境中反應良好。第三部分:Sunitinib藥物涂層支架動物實驗目的:在兔頸動脈模型中檢測Sunitinib藥物涂層支架的安全性和有效性。方法:將Sunitinib藥物涂層支架(12枚)植入至兔頸動脈內。對照組為:將裸支架植入至兔頸動脈內(12枚)。術后在30、60、90d進行B型超聲檢查,觀察支架的通暢率,記錄頸動脈流速峰值(peak systolic velocity,PSV),處死前行頸動脈血管造影術,明確支架有無移位和通暢情況。處死后將兔頸動脈標本分為三段:第一段行蘇木素-伊紅染色,觀察30、90d支架植入后內膜增生情況;第二段行掃描電鏡檢查;觀察支架植入后內皮化情況;第三段行p-ERK的Western blot分析,探討體內實驗中,Sunitinib藥物涂層支架抑制內膜增生的分子生物學機制。結果:24只新西蘭大白兔在觀察期間無死亡。B超提示24枚支架均通暢,造影提示支架在位,無移位、斷裂。金屬裸支架組PSV在觀察期間可見輕微上升趨勢,但無統(tǒng)計學意義,Sunitinib涂層支架PSV在觀察期間未見上升趨勢。90d后,內膜平均厚度:裸支架組:0.22±0.05mm,Sunitinib涂層支架組0.16±0.06 mm,P=0.03。金屬裸支架和Sunitinib涂層支架內皮化程度未見明顯差異:BMS:91.7±3.7%,SES:89.5±6.8%,P=0.24。Western blot 結果表明 Sunitinib 涂層支架可以通過抑制病理性平滑肌的p-ERK的表達,抑制內膜的增生。結論:在兔頸動脈模型中,Sunitinib藥物涂層支架可抑制內膜增生,且不損害內皮化進程,這些作用是通過下調增生內膜p-ERK的表達得以實現。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R543

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本文編號：1635845