本文選題：低氧誘導(dǎo)　切入點(diǎn)：肺動脈高壓　出處：《鄭州大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一種與肺血管痙攣、肺血管重塑及肺血栓形成導(dǎo)致的肺血管阻力增加緊密相關(guān)的異常血流動力學(xué)疾病,若未及時治療,病情進(jìn)行性發(fā)展可發(fā)生右心衰竭而死亡。其發(fā)病機(jī)制涉及細(xì)胞異常、分子介質(zhì)和遺傳因素等多個途徑,肺血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損、肺血管收縮反應(yīng)增強(qiáng)和血管重建、炎癥和免疫失調(diào)等參與形成,多種血管活性物質(zhì)失衡促進(jìn)其發(fā)生。低氧性肺動脈收縮(hypoxic pulmonary artery vasoconstriction,HPV)和低氧性肺血管重建(hypoxic pulmonary vascular remodeling,HPVR)是PAH的主要病理生理變化,特別是肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)的增殖起了重要的作用,盡管PAH發(fā)病機(jī)制未完全明確,目前增殖與凋亡的失平衡(尤其是PASMCs)越來越受到重視,并成為研究的熱點(diǎn)。微小RNA(micro RNA,miRNA)是在真核細(xì)胞中廣泛存在的非編碼、高度保守、單鏈、小分子RNA(長度約22個氨基酸),能夠通過完全和(或)部分互補(bǔ)的原則結(jié)合靶基因m RNA的3’UTR區(qū)域堿基調(diào)控靶基因的表達(dá),從而參與調(diào)控個體發(fā)育、分化、增殖及凋亡等生命活動。人類基因組中有300多個miRNA基因簇,miR-17家族又叫miR-106b家族,是由6個序列相似、結(jié)構(gòu)相仿、種子序列相同(AAAGUGCU)、物種間高度保守的成熟體miRNA組成,許多研究表明其中miR-17家族由于參與哺乳動物心、肺、免疫系統(tǒng)等器官發(fā)育并與實(shí)體腫瘤的發(fā)生緊密相關(guān)而受到廣泛關(guān)注。線粒體融合蛋白2(mitofusin2,Mfn2)是線粒體融合蛋白家族的成員,不僅是維持線粒體正常形態(tài)和發(fā)揮必要分子特征的重要元素,同時還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能的作用,研究發(fā)現(xiàn)Mfn2可以抑制PI3K/Akt信號通路,使線粒體外膜通透性增高,激活線粒體凋亡途徑,促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells VSCMs)凋亡。Mfn2在心血管疾病中對VSCMs增殖發(fā)揮重要作用且被深入研究,那么其對低氧性肺動脈高壓中PASMCs是否具有同樣作用還不清楚。近年來有研究發(fā)現(xiàn)miR-17可通過PDLIM5或BMPR2等下調(diào)miR-17的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞的增殖或凋亡,參與肺動脈平滑肌細(xì)胞的調(diào)控,從而導(dǎo)致肺動脈高壓的發(fā)生。然而miR-17在肺動脈高壓疾病中參與的研究多是動物模型水平,miR-17及Mfn2在低氧誘導(dǎo)的動物肺動脈高壓模型中發(fā)揮著重要作用,然而miR-17是否可以通過靶向調(diào)節(jié)Mfn2在人離體肺動脈平滑肌細(xì)胞模型等臨床研究中發(fā)揮作用并未報道。因此,我們推測miR-17的表達(dá)下調(diào)可能通過靶向調(diào)節(jié)Mfn2的表達(dá)從而抑制PASMCs的增殖并延緩肺動脈高壓的發(fā)生。目的該課題擬以肺動脈高壓患者的肺組織標(biāo)本和低氧誘導(dǎo)肺動脈平滑肌細(xì)胞為材料,模擬PAH的慢性缺氧過程,通過實(shí)時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)和免疫印跡(Western Blot)分別檢測miR-17和Mfn2蛋白在肺動脈高壓(PAH)患者肺組織及正常肺組織中的表達(dá)水平,通過雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-17與靶基因的作用位點(diǎn),探索miR-17及其靶基因?qū)θ毖鮌ASMCs的增殖、凋亡及相關(guān)蛋白的影響。方法1.為了模擬PAH的慢性缺氧過程,我們把PASMCs在低氧(即3%O2、5%CO2、92%氮?dú)?的條件下培養(yǎng)48 h,然后收取細(xì)胞,通過實(shí)時熒光定量PCR(q RT-PCR)和Western Blot技術(shù)檢測正常和缺氧處理的PASMCs miR-17和Mfn2表達(dá)水平。2.在缺氧處理的PASMCs中,運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的anti-miR-17和anti-miR-NC,在低氧條件下培養(yǎng)48 h后收取細(xì)胞進(jìn)行q RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測miR-17表達(dá)水平,通過噻唑藍(lán)(MTT)實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖活性,進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)檢測增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell Nuclear Antigen,PCNA)的表達(dá)情況;進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測肺動脈平滑肌細(xì)胞凋亡情況,并且檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的活性,研究miR-17表達(dá)抑制對肺動脈平滑肌細(xì)胞細(xì)胞增殖、凋亡的影響。3.在肺動脈平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-17 mimics、anti-miR-NC和anti-miR-17,48 h后收取細(xì)胞,熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-17和Mfn2m RNA3’UTR的結(jié)合情況,運(yùn)用western blot檢測miR-17 mimics、anti-miR-17對Mfn2蛋白表達(dá)的影響。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-17對低氧條件下肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控機(jī)制,我們在肺動脈平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染si Mfn2抑制內(nèi)源性Mfn2蛋白的表達(dá),觀察si Mfn2對anti-miR-17增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用的影響,運(yùn)用western blot檢測PCNA以及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果1.和正常肺組織樣本相比,miR-17在肺動脈高壓患者肺組織中的表達(dá)明顯增多,而Mfn2蛋白表達(dá)水平下調(diào)。q RT-PCR和western blot檢測結(jié)果顯示,和常氧處理的肺組織對照組相比,缺氧處理組細(xì)胞miR-17表達(dá)量上升,Mfn2蛋白表達(dá)降低。2.和anti-miR-NC對照組細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染anti-miR-17的肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖活性明顯降低。轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑anti-miR-17后,PCNA的蛋白表達(dá)水平下降。相比anti-miR-NC對照組,anti-miR-17組細(xì)胞凋亡率和Caspase-3活性明顯升高。3.與共轉(zhuǎn)染miR-NC和Mfn2-3’UTR報告基因載體組相比,共轉(zhuǎn)染miR-17mimics和Mfn2-3’UTR報告基因載體后,螢火蟲熒光素酶活性明顯降低。與共轉(zhuǎn)染miR-NC和Mfn2-Mut-3’UTR報告基因載體組相比,共轉(zhuǎn)染miR-17 mimics和Mfn2-Mut-3’UTR報告基因載體后,螢火蟲熒光素酶活性沒有明顯變化,miR-17對螢火蟲熒光素酶活性的抑制作用消失。轉(zhuǎn)染miR-17 mimics的細(xì)胞,Mfn2蛋白表達(dá)水平明顯降低,而轉(zhuǎn)染anti-miR-17后,Mfn2蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)。在PASMCs轉(zhuǎn)染anti-miR-17和si Mfn2,抑制miR-17和內(nèi)源性Mfn2蛋白的表達(dá),觀察肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡的變化。和anti-miR-NC+si NC組細(xì)胞相比,anti-miR-17+si Mfn2組細(xì)胞增殖活性降低,增殖蛋白PCNA表達(dá)降低,細(xì)胞凋亡率和Caspase-3活性上升,凋亡相關(guān)蛋白Caspas-3表達(dá)升高。結(jié)論1.miR-17在缺氧肺動脈平滑肌細(xì)胞和肺動脈高壓患者肺組織表達(dá)上調(diào),而Mfn2表達(dá)下調(diào)。2.降低miR-17的表達(dá)能夠抑制低氧條件下肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖,促進(jìn)肺動脈平滑肌細(xì)胞凋亡。3.miR-17通過靶向調(diào)控Mfn2基因表達(dá),調(diào)控低氧條件下肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡。綜上所述,miR-17/Mfn2調(diào)控途徑是缺氧誘導(dǎo)肺動脈平滑肌細(xì)胞過度增殖和凋亡減少的重要調(diào)節(jié)機(jī)制,miR-17可能成為防治肺動脈高壓的潛在治療靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R544.1

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