本文選題：條件性靶細(xì)胞清除　切入點(diǎn)：hCD59　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的近三十年,生物學(xué)研究在不斷更新的科學(xué)技術(shù)帶動(dòng)下得到了快速發(fā)展。在基因水平的研究中,無論是在體內(nèi)還是體外,靶基因敲除和過表達(dá)技術(shù)已經(jīng)成為研究特定基因功能的強(qiáng)有力的手段。在細(xì)胞水平的研究中,針對(duì)靶細(xì)胞群體的體內(nèi)清除對(duì)研究特定細(xì)胞群體的功能和疾病的關(guān)系有重要價(jià)值。更重要的是,特異性細(xì)胞清除還適用于研究細(xì)胞的再生、細(xì)胞和組織分化,這對(duì)再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展有著深遠(yuǎn)的意義。然而,目前體內(nèi)清除細(xì)胞技術(shù)與基因敲除技術(shù)相比相對(duì)落后和有限。早期的體內(nèi)細(xì)胞清除研究主要使用諸如外科手術(shù)的方法在小鼠體內(nèi)清除靶細(xì)胞群,例如,通過顯微解剖、激光清除和抗體介導(dǎo)的細(xì)胞清除。但是由于這些方法往往存在技術(shù)難度、重復(fù)率低、造價(jià)高、效果差和對(duì)非靶細(xì)胞有毒性等弊端,其使用受到限制。近年來,基因工程學(xué)方法開始用于細(xì)胞的體內(nèi)清除,包括：通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在靶細(xì)胞中表達(dá)C aspase-3或 Caspace-8來促使靶細(xì)胞凋亡、在靶細(xì)胞表面表達(dá)單皰疹病毒1胸苷激酶(Herpes simplex virus 1 thymidine kinase, HSVtk)或者白喉毒素(Diphtheria toxin, DT)受體(DT receptor, DTR),再用核苷類似物或DT毒素在小鼠體內(nèi)清除靶細(xì)胞。雖然這些方法大大提高了體內(nèi)清除靶細(xì)胞的效率,但仍然存在不可忽視的弊端。通過轉(zhuǎn)基因表達(dá)Caspase-3或Caspase-8誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物仍然存在毒性,而且清除靶細(xì)胞的速率很低。HSVtk轉(zhuǎn)基因小鼠模型只能用于清除進(jìn)行分裂的細(xì)胞,而對(duì)于未進(jìn)行分裂的細(xì)胞不適用。DT/DTR介導(dǎo)的細(xì)胞清除是近二十年來應(yīng)用最廣泛的模型,但DT本身的毒性作用導(dǎo)致它的藥理學(xué)安全窗口很窄,在實(shí)際研究中很難進(jìn)行劑量依賴性細(xì)胞清除研究。故迫切需要建立一種更有效、簡便和安全窗口大的細(xì)胞清除方法。中間鏈球菌毒素(Inrermedilysin, ILY)是一種由中間鏈球菌分泌的膽固醇依賴性細(xì)胞溶解素�？赏ㄟ^和細(xì)胞表面的人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD59分子特異結(jié)合發(fā)生多聚化,然后在細(xì)胞膜上形成細(xì)胞毒性孔道來裂解人的細(xì)胞。由于ILY僅選擇性結(jié)合人的CD59 (human CD59, hCD59),而不結(jié)合其他種屬的CD59,故對(duì)動(dòng)物來說是很安全的。我們實(shí)驗(yàn)室在前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ILY在hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)可選擇性有效清除表達(dá)hCD59的紅細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。提示hCD59聯(lián)合ILY對(duì)細(xì)胞的殺傷可以成為一種新的動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞清除方法。但如何利用簡單的方法建立多種靶細(xì)胞特異表達(dá)hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠,以便利用ILY選擇性清除靶細(xì)胞、使這種模型有更廣泛的應(yīng)用價(jià)值,成為亟待解決的問題。Cre是一種噬菌體的重組酶,它可以通過識(shí)別兩個(gè)鄰近的LoxP位點(diǎn)對(duì)位點(diǎn)間的基因序列進(jìn)行環(huán)化切除,已被廣泛應(yīng)用于條件性基因敲除或條件性敲入小鼠的制備。如果能建立帶有LoxP的hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠,將可利用現(xiàn)有的千余種細(xì)胞特異性表達(dá)Cre的轉(zhuǎn)基因小鼠,制備出依賴Cre表達(dá)調(diào)控細(xì)胞特異性表達(dá)hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠,進(jìn)而用ILY方便地選擇性清除多種靶細(xì)胞。因此本論文的目標(biāo)為：1.制備LoxP-hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠(ihCD59、鼠),并通過與細(xì)胞特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠(Cre+小鼠)雜交,獲得細(xì)胞特異性表達(dá)hCD59的雙轉(zhuǎn)基因小鼠(Cre+ ihCD59+小鼠)。2.通過注射ILY在生理?xiàng)l件下和不同疾病模型中檢測(cè)其對(duì)小鼠體內(nèi)多種靶細(xì)胞的清除效果,研究其在細(xì)胞再生、修復(fù)和疾病研究中的應(yīng)用。方法一, LoxP-Stop-LoxP-hCD59小鼠和細(xì)胞特異性表達(dá)人CD59轉(zhuǎn)基因小鼠的制備(一) Lox-Stop-Lox-hCD59重組表達(dá)載體的構(gòu)建1.制備Cre條件性表達(dá)hCD59載體通過將hCD59開放讀碼框插入CAG啟動(dòng)子及兩端有LoxP位點(diǎn)的STOP轉(zhuǎn)錄終止元件(LSL)的下游,得到pCAG-LSL-hCD59載體。2.體外驗(yàn)證pCAG-LSL-hCD59載體的Cre依賴性在NIH 3T3細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染pCAG-LSL-hCD59載體和Cre重組酶表達(dá)載體(Cre+)或者單獨(dú)轉(zhuǎn)染pCAG-LSL-hCD59載體(Cre-),轉(zhuǎn)染48小時(shí)后用hCD59熒光染色檢測(cè)細(xì)胞表面hCD59分子表達(dá)情況。(二)LSL-hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠(ihCD59小鼠)的制備利用TARGATT技術(shù),把CAG-LSL-hCD59的載體序列和體外轉(zhuǎn)錄得到的mRNA混合物通過TARGATTTM技術(shù)顯微注射入80個(gè)FVB遺傳背景的受精卵前核中,然后這些受精卵被移植入四只CD1培育小鼠體內(nèi)。通過TARGATTTM載體上的attB位點(diǎn)和染色體上的attP位點(diǎn)之間的遺傳重組,轉(zhuǎn)基因CAG-LSL-hCD59被整合在H11位點(diǎn)。顯微注射后共得到了23只子代小鼠,利用PCR檢測(cè)小鼠基因組DNA中是否成功整合了LSL-hCD59序列。(三)系統(tǒng)表達(dá)Cre和hCD59雙轉(zhuǎn)基因小鼠的制備1.獲得系統(tǒng)表達(dá)hCD59的Meox2Cre+ihCD59+小鼠將ihCD59小鼠與系統(tǒng)表達(dá)Cre的Meox2Cre+小鼠雜交。在子代小鼠中通過基因鑒定得到基因組表達(dá)hCD59的Meox2Cre+ihCD59+雙轉(zhuǎn)基因小鼠和沒有hCD59表達(dá)的Meox2Cre-ihCD59+小鼠(雙轉(zhuǎn)基因小鼠中的+代表+/-雜合子)。2.檢測(cè)Meox2Cre+ihCD59+小鼠體內(nèi)hCD59在各個(gè)器官的表達(dá)通過流式細(xì)胞術(shù)和免疫組織化學(xué)染色確定hCD59在Meox2Cre+ihCD59+小鼠的循環(huán)系統(tǒng)和各器官中的表達(dá)情況。以Meox2Cre-ihCD59+小鼠和C57BL/6小鼠作為對(duì)照。(四)多種細(xì)胞特異性表達(dá)Cre和hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠的制備1.T細(xì)胞、髓系細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞特異表達(dá)hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠的制備1)通過雜交誘導(dǎo)hCD59在T細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表達(dá)：為了使hCD59特異的表達(dá)在T細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中,首先將ihCD59小鼠與多個(gè)Cre特異表達(dá)的小鼠雜交,包括LckCre+小鼠、LyzCre+、鼠和(CD11cCre+、鼠。通過基因鑒定在子代小鼠中得到hCD59表達(dá)陽性的Cre+ihCD59+雙轉(zhuǎn)基因小鼠。2)檢測(cè)hCD59的表達(dá)特異性：通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hCD59在各個(gè)子代Cr+ihCD59+雙轉(zhuǎn)基因小鼠品系外周血中的表達(dá)。2.肝臟細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞特異表達(dá)hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠系的制備1)用多個(gè)方法誘導(dǎo)hCD59特異的在肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞中表達(dá)：①用ihCD59小鼠和AlbCre+小鼠雜交使hCD59在子代小鼠的肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)。②用Alb啟動(dòng)子調(diào)控的腺病毒表達(dá)載體Ad-AlbCre+感染ihCD59小鼠使hCD59在小鼠肝細(xì)胞中表達(dá)。③用ihCD59小鼠和tamoxifen誘導(dǎo)性5ox9creERT+小鼠雜交使hCD59在子代小鼠的膽管上皮細(xì)胞中表達(dá)。2)檢測(cè)hCD59在肝臟細(xì)胞中的表達(dá)：用hCD59抗體和膽管上皮細(xì)胞標(biāo)志分子CK19進(jìn)行免疫熒光染色檢測(cè),檢測(cè)肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞中hCD59的特異表達(dá)。3.星形膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠的制備1)制備有hCD59表達(dá)的mGFAP-Cre+ihCD59+小鼠：用ihCD59小鼠和mGFAP-Cre+、鼠雜交,通過基因鑒定得到hCD59表達(dá)的mGFAP-Cre+ihCD59+小鼠。2)檢驗(yàn)hCD59在星型膠質(zhì)細(xì)胞中的特異表達(dá)：對(duì)mGFAP-CreihCD59+小鼠的腦冰凍切片進(jìn)行GFAP和hCD59的免疫熒光共染色,確定hCD59在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的特異表達(dá)。二、ILY/ihCD59介導(dǎo)的靶細(xì)胞清除方法在生理和病理?xiàng)l件下的應(yīng)用(一)ILY的制備及活力測(cè)定和藥理學(xué)特性的測(cè)定1.ILY的表達(dá)、純化及活性檢測(cè)1)將裝載有重組ILY的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到XL1-blue大腸桿菌中。用TB培養(yǎng)基搖菌,待培養(yǎng)液OD600達(dá)到0.5左右時(shí)加入IPGT誘導(dǎo)蛋白質(zhì)大量表達(dá)。過夜培養(yǎng)后通過離心將菌體收集。2)用裂解液結(jié)合高速離心裂解大腸桿菌,通過His親和柱分離純化大腸桿菌裂解液中帶有His標(biāo)記的重組ILY。3)將含洗脫的ILY加到內(nèi)毒素親和柱上,按照說明書濾出的即為無內(nèi)毒素的ILY。4)將ILY加入透析膜進(jìn)行透析48小時(shí)去除洗脫液。5)用聚丙烯酰胺凝膠電泳確定ILY濃度,以已知濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)液作為參照。6)體外紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)檢測(cè)提純的ILY的活性,用熱滅活I(lǐng)LY作為對(duì)照。2.檢測(cè)ILY的藥理學(xué)特征用高于實(shí)驗(yàn)濃度十倍到二十倍的ILY及熱滅活的ILY分別注射ihCD59小鼠,確定ILY的藥理學(xué)特性,檢測(cè)注射后不同組織中ILY的分布以及對(duì)動(dòng)物體是否具有毒性。3.檢測(cè)膽固醇對(duì)ILY作用的影響方法同紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn),在反應(yīng)體系中加入不同濃度的膽固醇(100ug/ml至1600ug/ml).(二)在生理狀態(tài)下ILY對(duì)靶細(xì)胞的清除1.生理狀態(tài)下ILY對(duì)免疫系統(tǒng)靶細(xì)胞的清除1)分離LckCre+ihCD59+小鼠的脾臟細(xì)胞并在體外進(jìn)行ILY孵浴,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ILY在體外對(duì)hCD59陽性細(xì)胞的殺傷效果。2)分別給予LckCre+ihCD59+小鼠、LckCre+ihCD59+小鼠和CD11cCre+ihCD59+小鼠單次或多次ILY尾靜脈注射(75ng/g小鼠體重),通過流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光染色檢測(cè)相應(yīng)小鼠中T細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在外周循環(huán)系統(tǒng)、脾臟和胸腺中的清除效果。3)檢測(cè)高濃度ILY(150ng/g和300ng/g)對(duì)LckCre+ihCD59+小鼠、LyzCre+ihCD59+小鼠和CD11cCre+ihCD59+小鼠體內(nèi)靶細(xì)胞的清除。4)檢測(cè)單次ILY殺傷LckCre+ihCD59+小鼠、LyzCre+ihCD59+小鼠和CD11cCre+ihCD59+小鼠體內(nèi)靶細(xì)胞后,靶細(xì)胞在外周循環(huán)系統(tǒng)和脾臟中的恢復(fù)情況。5)檢測(cè)ILY對(duì)LyzCre+ihCD59+小鼠肝臟中巨噬細(xì)胞和枯否細(xì)胞的殺傷和細(xì)胞損傷后的修復(fù)。2.生理狀態(tài)下ILY對(duì)實(shí)質(zhì)器官中細(xì)胞的清除及細(xì)胞清除后再生的影響1)在不同小鼠系中檢測(cè)ILY對(duì)肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的清除對(duì)AlbCre+ihCD59+小鼠(肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞均表達(dá)hCD59). Ad-AlbCre+ihCD59+小鼠(肝細(xì)胞表達(dá)hCD59)和經(jīng)tamoxifen誘導(dǎo)過的Sox9Cre+ihCD59+小鼠(膽管上皮細(xì)胞表達(dá)hCD59)進(jìn)行ILY尾靜脈注射,并測(cè)量小鼠血清中ALT和膽紅素變化。2)檢測(cè)肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞受損后的修復(fù)在ILY注射40h后收集小鼠肝臟,通過BrdU染色檢測(cè)各個(gè)小鼠系中肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的增殖。3)利用ILY對(duì)小鼠肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的有效清除模擬了慢性損傷模型,對(duì)AlbCre+ ihCD59+小鼠、Ad-AlbCre+ihCD59+小鼠和Sox9Cre ERT+ihCD59+小鼠分別進(jìn)行了為期9天的多次ILY尾靜脈注射(150ng/g,每三天注射一次),在最后一次ILY注射48小時(shí)后收集各組小鼠器官,用免疫組化染色檢測(cè)肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的增殖。(三)ILY/ihCD59介導(dǎo)的靶細(xì)胞清除在研究病理機(jī)制方面的應(yīng)用1.免疫細(xì)胞清除與急性肝損傷1)清除DC細(xì)胞對(duì)α-GalCer誘導(dǎo)急性肝損傷的影響對(duì)CD11cCre+ ihCD59+小鼠進(jìn)行尾靜脈注射ILY或PBS,1小時(shí)后用a-Galcer誘導(dǎo)肝損傷。24小時(shí)后檢測(cè)血清中的細(xì)胞因子和ALT變化。2)清除T細(xì)胞、B細(xì)胞和髓系細(xì)胞對(duì)Con A誘導(dǎo)急性肝損傷的影響對(duì)LckCre+ ihCD59+小鼠,CD19Cre+ihCD59+小鼠,LyzCre+ihCD59+小鼠和ihCD59+小鼠進(jìn)行尾靜脈注射ILY或PBS。3小時(shí)后用ConA誘導(dǎo)肝損傷。24小時(shí)后檢測(cè)血清中AST和ALT變化以及對(duì)肝臟進(jìn)行HE染色。2.清除T細(xì)胞、B細(xì)胞和髓系細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的影響1)建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型(EAE)：用MOG免疫LckCre+ihCD59+小鼠,(:D19Cre+ihCD59+小鼠,LyzCre+ihCD59+小鼠和ihCD59+小鼠,誘導(dǎo)EAE發(fā)生。(2)ILY清除免疫細(xì)胞：免疫小鼠3天后開始對(duì)小鼠進(jìn)行ILY注射,持續(xù)17天。每天觀察并記錄小鼠EAE發(fā)病的臨床分?jǐn)?shù),免疫后第17天處死小鼠并觀察小鼠脊髓中MBP和神經(jīng)絲的變化。3.清除星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復(fù)的影響(1)腦損傷模型：用立體定位系統(tǒng)對(duì)mGFAP-Cre+ihCD59+小鼠造成腦損傷,并在損傷局部添加ILY處理殺傷膠質(zhì)細(xì)胞。在損傷后7天收集腦組織進(jìn)行切片染色,檢測(cè)膠質(zhì)細(xì)胞的清除水平。(2)脊髓損傷模型：對(duì)mGFAP-Cre+ ihCD59+小鼠制造脊髓損傷,用明膠海綿在損傷局部添加ILY處理殺傷膠質(zhì)細(xì)胞。在術(shù)后觀察小鼠行動(dòng)力的恢復(fù)情況,損傷后7天收集脊髓,檢測(cè)損傷區(qū)域膠質(zhì)細(xì)胞的清除情況。結(jié)果一、獲得了LoxP-Stop-LoxP-hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠(ihCD59小鼠)通過將hCD59開放讀碼框插入CAG啟動(dòng)子及兩端有LoxP位點(diǎn)的STOP終止元件(LSL)下游,得到pCAG-LSL-hCD59載體；利用體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),轉(zhuǎn)染pCAG-LSL-hCD59載體的NIH3T3細(xì)胞僅在共轉(zhuǎn)染Cre重組酶表達(dá)載體的情況下,細(xì)胞膜表面有hCD59表達(dá)；通過Applied Stem Cell Inc公司的TARGATTTM定點(diǎn)敲入技術(shù),把CAG-LSL-hCD59序列插入到FVB/NJ小鼠基因組的Hipp11(H11)位點(diǎn),獲得Cre誘導(dǎo)性表達(dá)的Lox-Stop-Lox-hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠(Cre inducible hCD59 mice, ihCD59小鼠)。在獲得的23只子代小鼠中,通過PCR方法驗(yàn)證hCD59是否整合入小鼠的基因組DNA中。檢測(cè)后共得到了一只ihCD59雌性小鼠和一只ihCD59雄性小鼠。值得說明的是,ihCD59小鼠為+/+純合子小鼠。二、獲得系統(tǒng)和多種細(xì)胞特異性表達(dá)Cre和hCD59的雙轉(zhuǎn)基因小鼠(Cre+ihCD59+小鼠)(一)獲得系統(tǒng)表達(dá)hCD59的月eox2Cre+ihCD59+小鼠通過將ihCD59小鼠和系統(tǒng)表達(dá)Cre重組酶的Meox2Cre+小鼠雜交,并對(duì)子代小鼠進(jìn)行基因鑒定,得到有hCD59表達(dá)的Meox2Cre+ ihCD59+、鼠和沒有hCD59表達(dá)的Meox2Cre-ihCD59+小鼠(雙轉(zhuǎn)基因小鼠中的+代表+/-雜合子)。通過流式細(xì)胞分析術(shù)和免疫組織化學(xué)染色,發(fā)現(xiàn)hCD59在Meox2Cre+ ihCD59+小鼠的所有器官均有表達(dá),而未表達(dá)于Meox2Cre-ihCD59+鼠和C57BL/6野生型小鼠中。說明通過ihCD59小鼠和Cre陽性小鼠雜交來獲得hCD59表達(dá)陽性的子代小鼠是可行的；hCD59小鼠的誘導(dǎo)性hCD59表達(dá)在各個(gè)器官中非常均一。同時(shí),hCD59在子代小鼠體內(nèi)的表達(dá)嚴(yán)格受到Cre的調(diào)控。(二)獲得多種細(xì)胞特異性表達(dá)hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠1.獲得T細(xì)胞、髓系細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞特異表達(dá)hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠通過將ihCD59小鼠分別與LckCre+小鼠、LyzCre+小鼠和(D11cCre+小鼠雜交,并對(duì)子代小鼠進(jìn)行基因鑒定,使hCD59特異表達(dá)在：LckCre+ihCD59+小鼠的T細(xì)胞、LyzCre+ihCD59+小鼠的髓系細(xì)胞和CD11cCre+ihCD59+小鼠的樹突狀細(xì)胞中。通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)hCD59僅在LckCre+ihCD59+小鼠的T細(xì)胞、LyzCre+ihCD59+小鼠的髓系細(xì)胞(如單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)以及CD11cCre+ihCD59+小鼠的樹突狀細(xì)胞中特異表達(dá)。2.獲得肝臟細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞特異表達(dá)hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠系用ihCD59小鼠和Albcre+小鼠雜交,在子代獲得hCD59在肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞同時(shí)表達(dá)的AlbCre+CD59+小鼠；用Alb啟動(dòng)子調(diào)控的腺病毒表達(dá)載體Ad-AlbCre感染ihCD59小鼠,得到Ad-AlbCre+ihCD59小鼠；用ihCD59、鼠和Sox9CreERT+小鼠雜交,并通過對(duì)子代Sox9CreERT+ihCD59+小鼠進(jìn)行tamoxifen誘導(dǎo),使hCD59在子代小鼠的膽管上皮細(xì)胞中表達(dá)。免疫熒光染色表明hCD59僅在AlbCre+ihCD59+小鼠的肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞中表達(dá)；在Ad-AlbCre+ihCD59+小鼠的肝細(xì)胞表達(dá);在sox9CreERT+ihCD59+小鼠的膽管上皮細(xì)胞表達(dá)。3.獲得星形膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠通過對(duì)mGFAP-Cre+ihCD59+小鼠的腦冰凍切片進(jìn)行GFAP和hCD59的免疫熒光共染色,我們發(fā)現(xiàn)hCD59只特異的表達(dá)在小鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中。三、ILY/ihCD59介導(dǎo)的靶細(xì)胞清除方法在生理和病理?xiàng)l件下的應(yīng)用(一)ILY的制備及活力測(cè)定和藥理學(xué)特性測(cè)定1.ILY的產(chǎn)出、純化及活性檢測(cè)：ILY在大腸桿菌中大量表達(dá)后,通過His親和柱純化,獲得純度高、不含內(nèi)毒素且具有活性的ILY。用熱滅活I(lǐng)LY和高于實(shí)驗(yàn)劑量二十倍的ILY對(duì)ihCD59小鼠進(jìn)行一次或多次注射,均未發(fā)現(xiàn)高劑量ILY對(duì)小鼠血常規(guī)指標(biāo)和各個(gè)器官組織結(jié)構(gòu)功能有任何影響。另外,發(fā)現(xiàn)在體外100ug/ml到1600ug/ml的外源膽固醇對(duì)ILY介導(dǎo)的細(xì)胞裂解無影響,為在高脂環(huán)境下應(yīng)用ILY清除靶細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。(二)在生理狀態(tài)下ILY對(duì)靶細(xì)胞的清除1.生理狀態(tài)下ILY對(duì)免疫系統(tǒng)靶細(xì)胞的清除1)ILY在體外成功殺傷了LckCre+ihCD59+小鼠的脾臟細(xì)胞中hCD59陽性的T細(xì)胞,而沒有影響B(tài)細(xì)胞。2)對(duì)小鼠進(jìn)行一次ILY尾靜脈注射可以分別有效清除LckCre+ihCD59+小鼠和LyzCre+ihCD59+小鼠外周血中的T細(xì)胞和單核細(xì)胞。ILY還可以分別清除CD11cCre+ihCD59+小鼠脾臟中的樹突狀細(xì)胞和LckCre+ihCD59+小鼠脾臟中的T細(xì)胞。并且,ILY在體內(nèi)對(duì)hCD59陽性細(xì)胞的殺傷作用存在ILY劑量依賴性。提高注射的ILY濃度可以一定程度的增加靶細(xì)胞被清除的效果。3)檢測(cè)了各種免疫細(xì)胞被單次ILY注射殺傷后的恢復(fù)再生情況。結(jié)果顯示,LckCre+ihCD59+小鼠和LyzCre+ihCD59+小鼠的外周血T細(xì)胞和單核細(xì)胞在ILY注射0.1小時(shí)后就可以被清除達(dá)90%,注射后24小時(shí)恢復(fù)到正常水平。同時(shí)發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞被清除后,Ly6C-細(xì)胞恢復(fù)的速度比Ly6C+細(xì)胞慢。LckCre+ihCD59+小鼠和CD11cCre+ihCD59+小鼠脾細(xì)胞中的T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在ILY注射后24h也可恢復(fù)到正常水平。而對(duì)小鼠進(jìn)行多次ILY注射可以將靶細(xì)胞水平長時(shí)間維持在較低的水平。4)ILY注射有效清除了L yzCre+ihCD59+小鼠肝臟局部F4/80陽性枯否細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。BrdU標(biāo)記顯示經(jīng)ILY殺傷后枯否細(xì)胞明顯發(fā)生增殖。我們對(duì)C57BL/6小鼠和LyzCre+ihCD59+小鼠進(jìn)行GFP標(biāo)記的單核細(xì)胞移植。在正常狀態(tài)下,移植后的C57BL/6小鼠肝臟中并不存在GFP陽性細(xì)胞。而經(jīng)過ILY注射的LyZCre+ihCD59+小鼠中,1.5%的枯否細(xì)胞表現(xiàn)為GFP陽性。說明在枯否細(xì)胞被急性清除狀態(tài)下,單核細(xì)胞參與了肝臟枯否細(xì)胞的再生。這一實(shí)驗(yàn)也說明ihCD59模型是研究免疫細(xì)胞分化和再生的有效工具。2.生理狀態(tài)下ILY對(duì)實(shí)質(zhì)器官中細(xì)胞的清除及細(xì)胞再生的影響1)ILY對(duì)肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的清除：在對(duì)AlbCre+ihCD59+小鼠(肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞均表達(dá)hCD59)、Ad-AlbCre+ihCD59小鼠(肝細(xì)胞表達(dá)hCD59)和經(jīng)tamoxifen誘導(dǎo)過的Sox9CreERT+ihhCD59+小鼠(膽管上皮細(xì)胞表達(dá)hCD59)進(jìn)行ILY注射后,我們通過免疫染色發(fā)現(xiàn)ILY注射可以引發(fā)AlbCre+ihCD59+小鼠體內(nèi)顯著的肝組織損傷和膽管損傷。同時(shí),肝損傷的程度呈現(xiàn)ILY濃度依賴性。在Ad-AlbCre+ihCD59小鼠中,ILY注射僅會(huì)引發(fā)肝細(xì)胞損傷。對(duì)經(jīng)過tamoxife誘導(dǎo)的sox9CreERT+ihCD59+小鼠進(jìn)行ILY注射會(huì)引起小鼠膽管損傷。2)肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的清除后再生：研究還發(fā)現(xiàn)ILY在AlbCre+ihCD59+小鼠引起肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞損傷40小時(shí)后,可以檢測(cè)到肝臟有明顯的肝細(xì)胞和心管上皮細(xì)胞的增殖。但是在Ad-AlbCre+ihCD59+小鼠中特異清除肝細(xì)胞40小時(shí)后僅能檢測(cè)到肝細(xì)胞增殖；而在Sox9CreERT+ihCD59+小鼠特異清除膽管上皮細(xì)胞后則可以檢測(cè)到肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞均有增殖。同時(shí),我們還對(duì)AlbCre+ihCD59+小鼠進(jìn)行多次ILY注射。發(fā)現(xiàn)慢性肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞損傷引發(fā)了肝臟纖維化,在纖維化部位還檢測(cè)到了肝臟祖細(xì)胞。但是只損傷肝細(xì)胞或者膽管上皮細(xì)胞則不會(huì)引起纖維化和肝臟祖細(xì)胞產(chǎn)生。(三)ILY/ihCD59介導(dǎo)的靶細(xì)胞清除在多種疾病模型中的應(yīng)用1.清除T細(xì)胞、B細(xì)胞和髓系細(xì)胞對(duì)急性肝損傷的影響1)利用α-Galcer誘導(dǎo)的肝損傷模型：我們發(fā)現(xiàn)在CD11icCre+ihCD59+小鼠中用ILY清除樹突細(xì)胞可以顯著緩解α-Galcer誘導(dǎo)的NKT細(xì)胞引發(fā)的急性肝損傷。2)利用Con A誘導(dǎo)的肝損傷模型：我們發(fā)現(xiàn)在LcCre+ihCD59+小鼠和LyzCre+ihCD59+小鼠中,ILY介導(dǎo)的T細(xì)胞和單核細(xì)胞清除都可以緩解甚至阻止ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷。但是在CD19Cre+ihCD59+小鼠中清除B細(xì)胞則沒有對(duì)ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷產(chǎn)生影響。2.清除T細(xì)胞、B細(xì)胞和髓系細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的影響采用EAE來驗(yàn)證ihCD59模型是否適用于研究慢性免疫性疾病中各免疫細(xì)胞的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,用ILY在LckCre+ihCD59+小鼠和LyzCre+ihCD59+小鼠中分別清除T細(xì)胞和單核細(xì)胞可以顯著抑制小鼠髓鞘受損程度,緩解EAE的發(fā)生,而在在CD19Cre+ihCD59+、鼠中清除B細(xì)胞則對(duì)疾病發(fā)生沒有明顯作用。3.清除星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復(fù)的影響1)利用腦損傷模型,我們發(fā)現(xiàn)在mGFAP-Cre+ihCD59+小鼠的腦損傷部位局部注射ILY可以清除損傷活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞,而尾靜脈注射ILY對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的清除效果有限。2)利用脊髓損傷模型,我們發(fā)現(xiàn)在,nGFAP-Cre+ihCD59+小鼠的脊髓損傷局部施加ILY處理也起到了消除反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞被清除的小鼠存在體重下降和活動(dòng)能力恢復(fù)緩慢的現(xiàn)象。結(jié)論1.ihCD59/ILY介導(dǎo)的細(xì)胞清除方法可以特異、快速地清除體內(nèi)靶細(xì)胞本研究成功建立了Cre條件性表達(dá)hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠(ihCD59小鼠),通過與不同品系的細(xì)胞特異性Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交,使hCD59特異表達(dá)在子代小鼠的靶細(xì)胞中。對(duì)子代小鼠進(jìn)行ILY注射可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶細(xì)胞的體內(nèi)清除。肝臟細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞清除模型實(shí)驗(yàn)顯示,ILY可以特異的在短時(shí)間內(nèi)分別清除肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞,而沒有引起任何非目標(biāo)效應(yīng)。更重要的是,研究發(fā)現(xiàn)\LYIihCD59介導(dǎo)的細(xì)胞清除存在ILY劑量依賴性。2. ihCD59/ILY介導(dǎo)的細(xì)胞清除方法可以被用于研究不同細(xì)胞在生理和疾病狀態(tài)下的功能ILY單次注射和多次注射可以引起短期的和長期的靶細(xì)胞清除,成為研究細(xì)胞再生以及細(xì)胞在急性疾病模型(如急性肝損傷和中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部創(chuàng)傷)或慢性病理過程(如EAE)中功能的有力手段。3.ILY具有很大的使用劑量范圍我們的實(shí)驗(yàn)表明比清除細(xì)胞的劑量高十到二十倍劑量的ILY對(duì)小鼠都是安全有效的,不會(huì)引起任何非靶細(xì)胞殺傷效應(yīng),對(duì)實(shí)驗(yàn)生物體也不存在毒副作用。創(chuàng)新性和意義本研究成功利用ILY和hCD59之間特異的相互作用,結(jié)合Cre重組技術(shù)實(shí)現(xiàn)了可誘導(dǎo)性的對(duì)多種細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)清除。與現(xiàn)存的其他細(xì)胞清除模型相比,ILY/ihCD59介導(dǎo)的細(xì)胞清除具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.ILY介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷更加迅速：ILY可以通過與hCD59特異結(jié)合,在數(shù)秒內(nèi)對(duì)細(xì)胞膜穿孔進(jìn)而裂解細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)對(duì)靶細(xì)胞的清除。2. ILY/ihCD59介導(dǎo)的細(xì)胞清除特異性更強(qiáng)：ILY只會(huì)結(jié)合hCD59,殺傷表達(dá)hCD59的細(xì)胞,而不會(huì)結(jié)合除人類之外其它生物的hCD59分子。因此,即使大量提高ILY的使用劑量也不會(huì)對(duì)其他非hCD59表達(dá)細(xì)胞產(chǎn)生影響。3.ILY具有很寬的藥理學(xué)安全窗口：基于ILY裂解細(xì)胞的特異性高,比有效清除靶細(xì)胞的劑量高十到二十倍劑量的ILY對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都是安全的,不會(huì)引起任何非靶細(xì)胞殺傷效應(yīng),對(duì)實(shí)驗(yàn)生物體本身不具有任何毒副作用。4.ILY介導(dǎo)的體內(nèi)細(xì)胞殺傷具有明顯的濃度依賴性：不同劑量的ILY可以引起不同程度的hCD59陽性靶細(xì)胞殺傷,這使ILY/ihCD59介導(dǎo)的細(xì)胞清除方法可以被用于需要不同程度清除細(xì)胞的研究。5.ILY的處理實(shí)施方便：在實(shí)驗(yàn)中,通過尾靜脈注射、腹腔注射、皮下注射和局部作用等方法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行ILY給藥,都可以發(fā)揮很好的細(xì)胞殺傷作用。ILY的給藥方式取決于靶細(xì)胞存在部位及狀態(tài),選擇靈活。研究局限性ILY作為一個(gè)小分子蛋白質(zhì),在生物體內(nèi)的擴(kuò)散有限,在一定程度上受到體內(nèi)屏障系統(tǒng)的限制。我們的研究結(jié)果顯示ILY可以更有效的殺傷絕大部分外周血中的細(xì)胞,清除部分實(shí)質(zhì)器官中的細(xì)胞,而對(duì)胸腺,骨髓和和中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞殺傷效果有限。目的動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是脂質(zhì)代謝異常誘導(dǎo)的血管壁的慢性炎癥,是多種心血管疾病(如,冠脈綜合征和腦中風(fēng))的病理基礎(chǔ),嚴(yán)重危害人類的健康。已知多種免疫細(xì)胞,特別是巨噬細(xì)胞在AS斑塊的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。在動(dòng)脈粥樣硬化的早期,血液中的脂質(zhì)成分通過受損的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入血管壁,進(jìn)而誘發(fā)血液中的單核細(xì)胞遷入血管壁,活化成為為巨噬細(xì)胞,吞噬和清除脂質(zhì),以減少斑塊的形成。隨著病程的進(jìn)展,如果脂質(zhì)過多,過度荷脂的巨噬細(xì)胞會(huì)變成泡沫細(xì)胞,釋放大量的炎性細(xì)胞因子和生長因子,促進(jìn)斑塊的發(fā)展和不穩(wěn)定性斑塊的形成,因此,抑制泡沫巨噬細(xì)胞的形成對(duì)減少斑塊的大小和改進(jìn)斑塊的穩(wěn)定性有重要價(jià)值。新近研究提示細(xì)胞自穩(wěn)或死亡的新形式-自噬(utophagy)調(diào)控巨噬細(xì)胞的功能、影響斑塊的不穩(wěn)定性。自噬是真核生物進(jìn)化中高度保守的對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行降解再利用的過程。細(xì)胞內(nèi)的可溶性分子(異常折疊的蛋白和脂質(zhì))和受損老化的細(xì)胞器都可以被包裹進(jìn)入囊泡,這種囊泡被稱為自噬體。自噬體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體,利用溶酶體中的水解酶將自噬體包裹的物質(zhì)分解,幫助細(xì)胞達(dá)到生存產(chǎn)物的合成、降解以循環(huán)利用間的平衡。已知自噬參入動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生和發(fā)展,特別是發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)的的巨噬細(xì)胞的自噬可抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展,巨噬細(xì)胞可通過脂自噬促進(jìn)脂滴的降解,促進(jìn)膽固醇外排,從而抑制泡沫巨噬細(xì)胞的形成,抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。故自噬已經(jīng)成為抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物研發(fā)的新靶點(diǎn)并已有相關(guān)藥物進(jìn)入臨床。因此尋找能通過調(diào)控自噬水平的制劑,有可能成為新的抗動(dòng)脈粥樣硬化的藥物。3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)是磷脂酰肌醇3磷酸激酶(PI3K)的抑制劑,由于它在饑餓時(shí)能通過抑制III型磷脂酰肌醇3磷酸激酶(Class ⅢP13K)的活性而抑制自噬,故在體外常作為自噬的抑制劑被廣泛使用。但有研究顯示,在營養(yǎng)豐富的條件下,3-MA的長時(shí)間作用,也可以抑制I型磷脂酰肌醇三磷酸(Class IPI3 K)促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生自噬。研究結(jié)果表明,3-MA在體內(nèi)通過抑制自噬減輕了大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫神經(jīng)炎的發(fā)病及控制腸道病毒71的感染和疾病發(fā)生。3-MA對(duì)高脂誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化有何影響?是通過抑制自噬還是促進(jìn)自噬發(fā)揮作用,尚不清楚。故本選用3-MA和另一種自噬抑制劑LY294002對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)行了干預(yù),具體的研究的目的是：一、研究小鼠體內(nèi)3-MA應(yīng)用對(duì)高脂誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化的影響；二、探索3-MA影響動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展的可能機(jī)制(抑制自噬或促進(jìn)自噬或有其他作用)方法一、研究3-MA在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用(一)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的誘導(dǎo)和3-MA干預(yù)1.第一次干預(yù)治療實(shí)驗(yàn)：將18只8周齡ApoE-/-小鼠隨機(jī)分成三組,每組6只小鼠：1)3-MA干預(yù)組(30mg/kg, Sigma,依據(jù)文獻(xiàn)[31])；同時(shí)以另一種自噬的抑制劑LY294002作為干預(yù)對(duì)照組(0.3mg/kg, Sigma,依據(jù)文獻(xiàn)[32])；PBS對(duì)照組小鼠。2)通過腹腔注射對(duì)小鼠進(jìn)行相應(yīng)的干預(yù)治療,每周兩次,共進(jìn)行8周。3)最后一次注射結(jié)束后一周對(duì)小鼠進(jìn)行解剖,收集心臟和主動(dòng)脈。2.第二次干預(yù)治療實(shí)驗(yàn)：根據(jù)第一次干預(yù)治療的結(jié)果將18只8周齡ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為兩組：3-MA治療組(10只)和PBS對(duì)照組(8只),按照第一次治療的方式重復(fù)實(shí)驗(yàn)。(二)檢測(cè)3-MA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和發(fā)展的影響1.收集所有小鼠的主動(dòng)脈,將主動(dòng)脈的內(nèi)壁充分暴露后進(jìn)行油紅O染色,分析陽性染色的主動(dòng)脈斑塊占主動(dòng)脈總面積的比例。2.取小鼠主動(dòng)脈根部制作成厚度為7um的連續(xù)冰凍切片,通過HE染色和油紅O染色分析主動(dòng)脈根部斑塊的大小和脂質(zhì)成分比例。3.通過對(duì)主動(dòng)脈根部冰凍切片進(jìn)行CD3、Moma-2、smc免疫組化染色和天狼星紅染色檢測(cè)斑塊中的炎性細(xì)胞浸潤情況和斑塊組成。4.通過TUNEL染色檢測(cè)斑塊中的凋亡細(xì)胞。5.通過公式計(jì)算小鼠的斑塊易損因子。二、研究3-MA抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展的可能機(jī)制(一)檢測(cè)3-MA在高脂環(huán)境對(duì)自噬的影響1.在體外,為了模擬體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的過程,我們的對(duì)小鼠腹腔分離的巨噬細(xì)胞添加ox-LDL刺激。在添加ox-LDL刺激的同時(shí),我們將細(xì)胞分為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組：ox-LDL單獨(dú)刺激組,3-MA預(yù)處理30分鐘后添加ox-LDL刺激組,雷帕霉素(Rap)預(yù)處理30分鐘后添加ox-LDL聯(lián)合刺激組。在各組添加刺激后的24、48和72小時(shí)分別收集細(xì)胞,提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)自噬標(biāo)記蛋白LC3和p62的表達(dá)水平。2.對(duì)小鼠主動(dòng)脈根部的冰凍切片進(jìn)行LC3免疫熒光染色,檢測(cè)斑塊中的自噬水平。(二)檢測(cè)3-MA對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化和存活的影響1.用小鼠主動(dòng)脈根部的冰凍切片進(jìn)行脂滴和LC3免疫熒光共染,分析斑塊中脂質(zhì)成分和自噬體分布的關(guān)系。2.在體外,將小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分成兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組：ox-LDL單獨(dú)刺激組,3-MA預(yù)處理30分鐘后添加ox-LDL刺激組。在各組添加刺激后的24、48和72小時(shí)分別對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色,統(tǒng)計(jì)油紅O染色為陽性的泡沫細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)量的比例。3.在體外,將小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分成兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組：ox-LDL單獨(dú)刺激組,3-MA預(yù)處理30分鐘后添加ox-LDL刺激組、Rap預(yù)處理30分鐘后添加ox-LDL刺激組。用CCK-8檢測(cè)各組添加刺激后的24、48和72小時(shí)的細(xì)胞存活率。(三)檢測(cè)3-MA對(duì)斑塊局部細(xì)胞因子的影響提取小鼠主動(dòng)脈的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行real-time PCR,檢測(cè)主要炎性和抑炎性細(xì)胞因子的表達(dá)情況,包括IL-17、IFN-yγ、IL-6、 TGF-(3、IL-10、IL-35的亞基IL-12αr和Ebi3及其相關(guān)亞基IL-1213和p28。還檢測(cè)了Treg細(xì)胞的標(biāo)志Foxp3的表達(dá)。結(jié)果一、研究3-MA抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成并促進(jìn)了斑塊的穩(wěn)定性,但另一個(gè)自噬抑制劑LY294002無作用(一)3-MA抑制了動(dòng)脈粥樣硬化的形成1.由于3-MA的水溶性差,常規(guī)體外實(shí)驗(yàn)采用DMSO溶解。為了克服DMSO的毒副作用,本研究采用PBS加熱溶解3-MA的方法,制備了低濃度水溶性3-MA,實(shí)驗(yàn)證明這種水溶性3-MA不僅不損傷肝腎功能,還降低了小鼠血清中的AST水平。2.通過主動(dòng)脈大體的油紅O染色,我們發(fā)現(xiàn)3-MA處理組小鼠主動(dòng)脈中的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊顯著少于PBS對(duì)照組小鼠,但LY294002處理組小鼠與對(duì)照組比較無明顯差異。3.對(duì)主動(dòng)脈根部冰凍切片進(jìn)行HE染色表明,與PBS對(duì)照組小鼠對(duì)比,3-MA處理組小鼠主動(dòng)脈根部的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積明顯減小。但LY294002處理組小鼠與對(duì)照組無明顯差異。4.對(duì)主動(dòng)脈根部冰凍切片進(jìn)行油紅O染色顯示,3-MA處理組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊中脂質(zhì)成分明顯低于對(duì)照組,但LY294002作用不明顯。(二)3-MA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性具有促進(jìn)作用1.通過對(duì)主動(dòng)脈根部進(jìn)行相應(yīng)的免疫組化染色我們發(fā)現(xiàn),3-MA對(duì)T細(xì)胞浸潤沒有顯著影響,但是明顯降低了巨噬細(xì)胞在斑塊中的比例,對(duì)斑塊中平滑肌細(xì)胞的比例也有一定程度的減少。天狼猩紅染色顯示3-MA處理組小鼠斑塊局部的膠原成分高于PBS對(duì)照組。TUNEL染色顯示3-MA處理顯著減少了小鼠斑塊中的凋亡細(xì)胞數(shù)量和壞死核心面積。2.通過計(jì)算和統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)3-MA處理組小鼠的斑塊易損因子明顯低于PBS對(duì)照組小鼠。但LY294002對(duì)斑塊穩(wěn)定性影響不大。二、研究3-MA抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展的可能機(jī)制(一)體外3-MA長時(shí)間處理促進(jìn)ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬、減少泡沫胞形成并降低巨噬細(xì)胞活力體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示用ox-LDL誘導(dǎo)腹腔巨噬細(xì)胞泡沫化的同時(shí)用3-MA長時(shí)間處理(24、48和72小時(shí))會(huì)顯著增加自噬標(biāo)志分子LC3的表達(dá),同時(shí)作為自噬底物的p62分子會(huì)明顯降低,說明3-MA3-MA長時(shí)間處理可促進(jìn)ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬。同時(shí),發(fā)現(xiàn)3-MA可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的泡沫巨噬細(xì)胞的形成和減低泡沫巨噬細(xì)胞的活力。說明在高脂環(huán)境下,3-MA可通過促進(jìn)自噬,促進(jìn)減少泡沫巨噬細(xì)胞形成和促進(jìn)自噬介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。(二)3-MA干預(yù)顯著降低了脂滴成分小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示斑塊局部脂滴減少,殘留的自噬陽性的巨噬細(xì)胞減少。采用免疫熒光染色檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈斑塊中脂滴和LC3陽性自噬體的水平,發(fā)現(xiàn)3-MA處理組小鼠斑塊中自噬體少于PBS對(duì)照組小鼠。但是3-MA處理顯著降低了小鼠斑塊中的脂滴成分。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)脂滴主要積累在LC3染色陰性的區(qū)域,而自噬體較多的LC3陽性區(qū)域的脂滴明顯減少。提示我么自噬有助于脂質(zhì)的代謝排出。但是用Western blot檢測(cè)LC3在小鼠主動(dòng)脈中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)3-MA處理組小鼠主動(dòng)脈壁中的LC3在蛋白水平要低于PBS對(duì)照小鼠,同時(shí)I型P13K通路在3-MA處理組也低于PBS對(duì)照組。結(jié)合體外實(shí)驗(yàn),提示3-MA干預(yù)可能通過促進(jìn)自噬有助于脂質(zhì)代謝,并且最終引起巨噬細(xì)胞的自噬性死亡和清除。(三)3-MA干預(yù)促進(jìn)了炎癥抑制性因子表達(dá)Real-time PCR顯示3-MA促進(jìn)了小鼠主動(dòng)脈血管壁中的抑炎性細(xì)胞因子IL-10、 TGF-β口IL-35的表達(dá),而對(duì)促炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-17和IFN-γ的表達(dá)水平?jīng)]有明顯的影響�？紤]到調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是主要的免疫負(fù)調(diào)控性細(xì)胞,我們也檢測(cè)了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的標(biāo)志分子Foxp3的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)3-MA處理組小鼠的Foxp3在轉(zhuǎn)錄水平明顯高于對(duì)照組小鼠,提示3-MA具有改善斑塊局部抗炎微環(huán)境的作用。結(jié)論一、3-MA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有顯著地抑制作用本研究證實(shí)3-MA顯著減小了高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈大體和根部的斑塊面積,并且顯著減少了斑塊中的脂質(zhì)成分。二、3-MA促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性3-MA有效增加了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊纖維帽區(qū)域的平滑肌細(xì)胞,并且減少了斑塊中浸潤的巨噬細(xì)胞和壞死細(xì)胞。3-MA處理組小鼠的斑塊易損系數(shù)明顯低于對(duì)照小鼠。以上現(xiàn)象均表明3-MA顯著促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。三、3-MA通過增強(qiáng)自噬水平,抑制巨噬細(xì)胞泡沫化并促進(jìn)其死亡在高脂環(huán)境中,3-MA長時(shí)間處理促進(jìn)了自噬的發(fā)生,從而有利于斑塊區(qū)域泡沫化細(xì)胞中的脂質(zhì)外排。3-MA還會(huì)影響高脂環(huán)境中巨噬細(xì)胞的存活率,在有效抑制細(xì)胞凋亡的狀態(tài)下,可能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的自噬性死亡,從而導(dǎo)致斑塊中巨噬細(xì)胞的數(shù)量減少。四、3-MA可以促進(jìn)斑塊局部抗炎性細(xì)胞因子的表達(dá)3-MA在體內(nèi)可以提高抗炎性細(xì)胞因子的水平,包括IL-10、TGF-β和IL-35,同時(shí)對(duì)Foxp3的表達(dá)水平也有促進(jìn),有助于維持斑塊局部的抗炎微環(huán)境。創(chuàng)新性和意義1.本實(shí)驗(yàn)第一次在小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中研究了3-MA長期作用對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響。2.本實(shí)驗(yàn)確定了低濃度溶解于PBS中的3-MA對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不存在毒副作用,反而對(duì)高脂喂養(yǎng)的小鼠具有保護(hù)作用,使3-MA及其衍生物成為研發(fā)治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物的新靶點(diǎn)。研究局限性1.本實(shí)驗(yàn)選用的LY294002并沒有對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)展起到顯著作用,有可能是因?yàn)檫x用的體內(nèi)治療濃度不合適本次實(shí)驗(yàn)。應(yīng)選用不同濃度的LY294002和3-MA確定它們?cè)隗w內(nèi)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的作用。2.鑒于自噬在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生早期和后期的活化水平和對(duì)細(xì)胞的影響可能不同,應(yīng)該分階段研究3-MA在動(dòng)脈粥樣硬化早期和后期的功能是否相同。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R543
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本文編號(hào)：1612094