本文選題：依魯替尼　切入點：NLRP3　出處：《大連醫(yī)科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：動脈粥樣硬化早期,單核細胞在趨化因子的作用下被招募至病變處,與內(nèi)皮細胞黏附,隨后遷移至內(nèi)皮下,轉(zhuǎn)化為巨噬細胞。巨噬細胞攝入ox-LDL(oxidized low-density lipoprotein,氧化低密度脂蛋白)形成泡沫細胞,并大量死亡,形成動脈粥樣硬化斑塊的壞死核心,削弱纖維帽,增加斑塊不穩(wěn)定性。巨噬細胞的泡沫化和死亡是動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年來NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein3,核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3)炎癥小體在動脈粥樣硬化中的作用越來越受到重視。研究顯示NLRP3炎癥小體參與動脈粥樣硬化的形成,并與斑塊的穩(wěn)定性相關(guān)。NLRP3炎癥小體可被ox-LDL激活,激活的炎癥小體可剪切caspase-1前體(Cysteine-requiring Aspartate Protease-1,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1),促進成熟IL-1β(Interleukin-1β,白介素1β)的釋放,誘導巨噬細胞焦亡,還可能參與細胞脂質(zhì)沉積。依魯替尼是一種口服的BTK(Bruton’s tyrosine kinase,布魯頓酪氨酸激酶)抑制劑,臨床上被用來治療白血病。研究發(fā)現(xiàn)依魯替尼可抑制明礬誘導的巨噬細胞NLRP3炎癥小體激活,尚不知其對ox-LDL誘導的NLRP3炎癥小體激活是否同樣有抑制作用。我們據(jù)此提出假說:依魯替尼可通過抑制NLRP3炎癥小體的激活調(diào)節(jié)ox-LDL誘導的巨噬細胞泡沫化和焦亡。目的:觀察依魯替尼對ox-LDL誘導的THP-1起源巨噬細胞泡沫化和焦亡的影響,探討其與NLRP3炎癥小體的關(guān)系。方法:以PMA誘導的THP-1或THP-1-defNLRP3起源巨噬細胞為研究對象。給予ox-LDL,構(gòu)建細胞泡沫化、焦亡、遷移和黏附模型,并分別用依魯替尼和MCC950(NLRP3特異性抑制劑)進行處理。采用Western Blot、ELISA方法檢測巨噬細胞NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1、IL-1β水平,觀察ox-LDL對巨噬細胞NLRP3炎癥小體激活的誘導作用,以及依魯替尼對ox-LDL誘導的巨噬細胞NLRP3炎癥小體激活的影響。采用油紅O染色、酶學法、免疫熒光、流式等方法觀察依魯替尼對巨噬細胞泡沫化、細胞內(nèi)膽固醇含量、脂質(zhì)攝入及膽固醇外流的影響,并采用Western Blot方法檢測依魯替尼對調(diào)節(jié)巨噬細胞膽固醇平衡的關(guān)鍵蛋白水平的影響,及其與NLRP3炎癥小體的關(guān)系。分別用依魯替尼、MCC950、VX765(caspase-1特異性抑制劑)等處理巨噬細胞,進行乳酸脫氫酶釋放檢測、Hoechst 33342和碘化丙啶雙染及TUNEL染色,驗證ox-LDL對巨噬細胞焦亡的誘導作用,觀察依魯替尼對ox-LDL誘導的巨噬細胞焦亡的影響,以及其與NLRP3炎癥小體的關(guān)系。采用transwell小室、劃痕實驗及細胞黏附實驗觀察依魯替尼對單核巨噬細胞遷移、黏附的影響及其與NLRP3炎癥小體的關(guān)系。結(jié)果:(1)依魯替尼可抑制ox-LDL誘導的THP-1起源的巨噬細胞NLRP3炎癥小體的激活。(2)依魯替尼、MCC950和NLRP3基因敲除均可以調(diào)節(jié)THP-1起源的巨噬細胞CD36、ABCA1和SR-BI蛋白表達水平,抑制細胞對ox-LDL的攝入,促進游離膽固醇外流,減輕細胞泡沫化程度。(3)Ox-LDL可促進THP-1起源巨噬細胞乳酸脫氫酶的釋放,增加PI染色細胞比率及TUNEL染色陽性率;依魯替尼、MCC950、VX765和NLRP3基因敲除均可抑制ox-LDL誘導的巨噬細胞乳酸脫氫酶的釋放,降低PI染色細胞比率及TUNEL染色陽性率。(4)依魯替尼和MCC950可不同程度的抑制THP-1細胞的遷移,但對THP-1細胞與內(nèi)皮細胞的黏附無顯著影響。結(jié)論:依魯替尼可能通過抑制NLRP3炎癥小體的激活抑制ox-LDL誘導的巨噬細胞泡沫化和焦亡。
[Abstract]:In the early stage of atherosclerosis, monocyte chemotactic factors are recruited to the lesion, adhesion and endothelial cells, then migrate to the endothelium, transformed into macrophages. Macrophages (oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL uptake of oxidized low density lipoprotein) to form foam cells, and a large number of deaths, the formation of atherosclerotic plaque necrosis core. Weaken the fibrous cap, increased plaque instability. Macrophage foam and death is the occurrence of atherosclerosis, the key to development. In recent years, NLRP3 (nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein3, nucleotide binding oligomerization domain protein like receptor 3) inflammasome in atherosclerosis is more and more attention. Research shows that the formation of NLRP3 inflammasome in atherosclerosis and plaque stability, and related.NLRP3 inflammasome Can be activated by ox-LDL, the activation of the inflammasome can shear the precursor of Caspase-1 (Cysteine-requiring Aspartate Protease-1, caspase -1), promote the mature IL-1 beta (Interleukin-1 beta, interleukin 1 beta) release of macrophages induced by focal dead, also may be involved in cellular lipid accumulation. Ibrutinib is an oral BTK (Bruton 's tyrosine kinase, Bruton tyrosine kinase inhibitor), were clinically used to treat leukemia. The study found that Yilu for alum can inhibit macrophages induced by NLRP3 inflammasome activation, is not known for its NLRP3 inflammasome activation of ox-LDL induced by whether it has the same inhibitory effect. We put forward the hypothesis: Yilu for Nicole through inhibition of NLRP3 inflammasome activation of ox-LDL induced macrophage foam and focal apoptosis. Objective: To observe the effect of ibrutinib on ox-LDL induced THP-1 derived macrophages Effects of cell foam and focal apoptosis, to explore the relationship between NLRP3 and inflammatory corpuscle. Methods: PMA induced THP-1 or THP-1-defNLRP3 macrophage origin as the research object. To construct ox-LDL, foam cell apoptosis, focal adhesion and migration model, and respectively with ibrutinib and MCC950 (NLRP3 specific inhibitor) were processing. Using Western Blot ELISA method for detection of macrophage NLRP3, pro-caspase-1, caspase-1, pro-IL-1, IL-1 levels, to observe the effect of ox-LDL on macrophage activation induced by NLRP3 inflammasome, and ibrutinib effect on ox-LDL induced macrophage NLRP3 inflammasome activation. The oil red O staining, immunofluorescence, enzyme method, observation Yilu imatinib on macrophage foam flow cytometry method, cellular cholesterol content, lipid intake and cholesterol efflux, and using the Western Blot method for detection of ibrutinib. Effect of key protein macrophage cholesterol homeostasis, and its relationship with NLRP3 inflammasome. With ibrutinib, MCC950, VX765 (Caspase-1 inhibitor) treatment of macrophages, lactate dehydrogenase release test, Hoechst 33342 and propidium iodide double staining and TUNEL staining, to verify the effect of ox-LDL on macrophage induced by focal dead the observation of ibrutinib effect on ox-LDL macrophages induced by focal death, and its relationship with NLRP3 inflammasome. By Transwell assay, scratch test and cell adhesion test observation of ibrutinib on mononuclear macrophage migration, adhesion and the relationship with NLRP3 inflammasome. Results: (1) Yilu for activation Nicole inhibited ox-LDL induced THP-1 macrophage origin NLRP3 inflammasome. (2) ibrutinib, MCC950 and NLRP3 gene knockout can regulate THP-1 derived macrophages Cell CD36, ABCA1 and SR-BI protein expression, inhibiting cell ox-LDL uptake, promote free cholesterol efflux, reduce the degree of foam cells. (3) Ox-LDL can promote THP-1 macrophage origin of lactate dehydrogenase release, increased PI staining and TUNEL staining positive cell ratio; ibrutinib, MCC950, VX765 and NLRP3 gene knockout in addition to macrophages can inhibit ox-LDL induced lactate dehydrogenase release, reduce PI staining and TUNEL staining. The ratio of the positive rate (4) ibrutinib and MCC950 can transfer different degrees of inhibition of THP-1 cells, but the adhesion of THP-1 cells and endothelial cells had no significant effect. Conclusion: ibrutinib can inhibit the inflammation of NLRP3 body activation inhibited ox-LDL induced macrophage foam and focal dead.

【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R543

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