本文選題：體外心臟震波　切入點(diǎn)：動(dòng)脈生成　出處：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：[背景]冠心病(CHD)病死、病殘率極高,已成為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)。現(xiàn)有CHD常規(guī)療法各有其局限性,體外心臟震波治療(Cardiac shock wave therapy,CSWT)是新興的CHD無創(chuàng)治療方法。CSWT對(duì)心肌組織發(fā)放低能量震波,該物理能量可在心肌組織內(nèi)產(chǎn)生剪切力和空穴效應(yīng),進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。課題組前期臨床研究已初步驗(yàn)證了 CSWT的有效性和安全性,相關(guān)動(dòng)物研究表明CSWT有促豬缺血心肌動(dòng)脈生成效應(yīng),而體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示CSWT可上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞促動(dòng)脈生成相關(guān)因子表達(dá)水平。但CSWT促動(dòng)脈生成效應(yīng)具體分子機(jī)制仍不清楚,有待進(jìn)一步研究。此外,以燈盞花為代表的中藥在臨床廣泛用于心腦血管病,且療效明確,CSWT聯(lián)用中藥燈盞花治療冠心病是否具有協(xié)同作用值得探討。第一部分:CSWT對(duì)人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究[目的]選取人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human cardiac microvascular endothelial cells,HCMEC)為研究對(duì)象,觀察CSWT對(duì)HCMEC促動(dòng)脈生成相關(guān)因子eNOS、VEGF、MCP-1和ITGB1表達(dá)的影響。同時(shí),觀察粘附性斑激酶抑制劑PF-573228和鈣敏感鉀通道阻斷劑Iberiotoxin對(duì)CSWT效應(yīng)的影響以揭示CSWT顯效相關(guān)信號(hào)通路。此外,采用中藥燈盞花乙素(SCU)和CSWT聯(lián)合干預(yù)HCMEC探討二者是否具有協(xié)同效應(yīng)。[方法]1.HCMEC細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)以及穩(wěn)定細(xì)胞實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的建立。2.藥物干預(yù) HCMEC細(xì)胞分為Control組、CSWT組、CSWT+FAK阻斷劑PF-573228 組、CSWT+KCa阻斷劑Iberiotoxin 組、CSWT+SCU50um 組、CSWT+SCU100um組、CSWT+SCU200um組。不同藥物刺激HCMEC細(xì)胞48h后收集細(xì)胞用于后續(xù)心臟振波治療。3.CSWT處理細(xì)胞每個(gè)實(shí)驗(yàn)組加藥刺激48h后接受1次低能量體外震波治療(0.09mJ/mm2,200Times)。4.經(jīng)CSWT處理的細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)ITGB1、eNOS、VEGF、MCP1 的表達(dá),western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) ITGB1、eNOS、VEGF、MCP1的表達(dá),免疫組化檢測(cè)檢測(cè)ITGB1、eNOS、VEGF、MCPI的表達(dá)。[結(jié)果]1.與對(duì)照組相比,CSWT干預(yù)組VEGF、eNOS、MCP-1的mRNA表達(dá)均上調(diào)(4.61±0.05倍,3.99±0.01倍,1.57±0.09倍),ITGB1的mRNA表達(dá)下調(diào)(0.54±0.14 倍),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);VEGF、eNOS、MCP-1、ITGB1蛋白相對(duì)表達(dá)灰度比值均升高(0.43與0.35,0.63與0.50,0.76與0.54,0.68與 0.63)。2.與 CSWT 組相比,CSWT+PF-57328 組 VEGF、eNOS、ITGB1 的 mRNA表達(dá)均下調(diào)(0.62±0.10倍,0.40±0.02倍,0.98±0.03倍)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但 MCP-1 的 mRNA 表達(dá)卻上調(diào)(17.1±0.01);VEGF、eNOS、ITGB1蛋白相對(duì)表達(dá)灰度比值降低(0.29與0.43,0.37與0.63,0.54與0.63),而MCP-1蛋白相對(duì)表達(dá)灰度比值卻升高(1.05與0.76)。3.與 CSWT 組相比,CSWT+Iberiotoxin組VEGF、eNOS、ITGB1 的 mRNA 表達(dá)均下調(diào)(0.53±1.02倍,0.64±0.02倍,0.35±0.01倍)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),MCP-1的mRNA表達(dá)也下調(diào)(0.82±0.02)但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);VEGF、eNOS、MCP-1、ITGB1蛋白相對(duì)表達(dá)灰度比值均降低(0.30 與 0.43,0.30 與 0.63,0.48 與 0.76,0.54 與 0.63)。4.與CSWT組相比,CSWT+SCU50um組VEGF的mRNA表達(dá)上調(diào)(5.98±0.05 倍),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而 eNOS、MCP-1、ITGB1 的mRNA 表達(dá)降低(0.29±0.02 倍,1.39±0.03 倍 0.39±0.01 倍);VEGF、eNOS蛋白相對(duì)表達(dá)灰度比值均升高(0.87與0.43,0.65與0.63,0.33與0.76),MCP-1、ITGB1蛋白相對(duì)表達(dá)灰度比值則降低(0.33與0.54,0.51與0.63)。5.與CSWT組相比,CSWT+SCU100um組VEGF的mRNA表達(dá)上調(diào)(5.29±0.31 倍),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而 eNOS、MCP-1、ITGB1 的mRNA 表達(dá)降低(0.27±0.04 倍,0.42±0.03 倍,0.,31 ±0.04 倍);VEGF、eNOS、MCP-1、ITGB1蛋白相對(duì)表達(dá)灰度比值均降低(0.03與0.35,0.13與0.50,0.31與 0.54,0.18與 0.63)。6.與CSWT組相比,CSWT+SCU200um組VEGF的mRNA表達(dá)上調(diào)(5.19±0.66 倍),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而 eNOS、MCP-1、ITGB1 的mRNA 表達(dá)降低(0.43±0.02 倍,0.86 ± 0.04,倍 0.,41±0.01 倍);VEGF、MCP-1、ITGB1蛋白相對(duì)表達(dá)灰度比值均降低(0.22與0.35,0.38與0.54,0.42與0.63),而eNOS蛋白相對(duì)表達(dá)灰度比值升高(0.87與0.50)。7.免疫組化檢測(cè)各組間eNOS、VEGF、MCP1表達(dá)量無顯著差異。[結(jié)論]1.CSWT可活化HCMEC上調(diào)eNOS,VEGF和MCP-1的表達(dá)水平,從而產(chǎn)生促動(dòng)脈生成效應(yīng);2.KCa和整合素-FAK信號(hào)軸可能參與了 CSWT誘導(dǎo)HCMEC表達(dá)eNOS和VEGF的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程;KCa可能作為機(jī)械感受器參與了 CSWT誘導(dǎo)HCMEC表達(dá)MCP-1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,但整合素-FAK信號(hào)軸可能不是該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一部分。3.CSWT聯(lián)合SCU干預(yù)HCMEC具有上調(diào)eNOS和VEGF表達(dá)水平的協(xié)同作用,該協(xié)同作用在SCU中低劑量組更為明顯。第二部分:CSWT對(duì)心肌梗死SD大鼠促動(dòng)脈生成效應(yīng)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究[目的]選取人SD大鼠為研究對(duì)象,探討CSWT對(duì)SD大鼠促動(dòng)脈生成相關(guān)的eNOS、VEGF、MCP-1和ITGB1表達(dá)的影響。同時(shí),觀察粘附性斑激酶抑制劑PF-573228和鈣敏感鉀通道阻斷劑Iberiotoxin對(duì)CSWT效應(yīng)的影響以揭示CSWT顯效相關(guān)信號(hào)通路。此外,采用中藥燈盞花乙素(SCU)和CSWT聯(lián)合干預(yù)SD大鼠探討二者是否具有協(xié)同效應(yīng)。[方法]1.采用開胸結(jié)扎前降支法建立SD大鼠急性心肌梗死模型2.實(shí)驗(yàn)大鼠分為Control組、CSWT組、CSWT+FAK 阻斷劑PF-573228 組、CSWT+KCa阻斷劑 Iberiotoxin 組、CSWT+SCU10mg/kg 組、CSWT+SCU30mg/kg 組、CSWT+SCU90mg/kg組。所有大鼠均以0.09mJ/mm2能量,按每周三次的頻率處理4周。3.完成CSWT刺激方案飼養(yǎng)1周后動(dòng)物處死,取心肌組織標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測(cè) ITGB1、eNOS、VEGF、MCP1 的表達(dá),western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) ITGB1、eNOS、VEGF、MCP1 的表達(dá),免疫組化檢測(cè)檢測(cè)ITGB1、eNOS、VEGF、MCP1的表達(dá)。[結(jié)果]1.與對(duì)照組相比,CSWT治療組VEGF、MCP-1的mRNA表達(dá)均上調(diào)(1.62±0.26倍,1.18±0.06倍),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P0.05),ITGB1的mRNA表達(dá)上調(diào)(2.58±0.05倍),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);而eNOS的mRNA表達(dá)則降低(0.96±0.03倍);VEGF、eNOS、ITGB1蛋白相對(duì)表達(dá)灰度比值降低(1.66與1.86,0.09與0.37,0.50與1.11),而MCP-1蛋白相對(duì)表達(dá)灰度比值升高(1.24與0.30)。2.與 CSWT 組相比,CSWT+PF-57328 組 VEGF、eNOS、ITGB1 的 mRNA表達(dá)均上調(diào)(2.09 ±0.06倍,2.50 士 0.07倍,2.28±0.02倍)但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但 MCP-1 的 mRNA 表達(dá)卻下調(diào) 0.71±0.04);eNOS、MCP-1、ITGB1蛋白相對(duì)表達(dá)灰度比值升高(0.70與0.09,1.73與1.24,0.76與0.63),而VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)灰度比值則降低(0.11與1.66,1.00與1.11)3.與 CSWT 組相比,CSWT+Iberiotoxin組VEGF、MCP-1 的 mRNA 表達(dá)均下降(1.58±0.11倍,0.449±0.02倍)但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),eNOS、ITGB1的mRNA表達(dá)則升高(1.17 土0.02,2.16土0.01)但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);VEGF、ITGB1蛋白相對(duì)表達(dá)灰度比值降低(0.77與1.66,0.84與1.11),而eNOS、MCP-1蛋白相對(duì)表達(dá)灰度比值升高(0.27與0.09,1.59與0.24)。4.與 CSWT 組相比,CSWT+SCU1Omg/kg 組VEGF、eNOS、MCP-1、ITGB1的 mRNA 表達(dá)均升高(2.66±0.07 倍,2.29±0.03 倍,2.10±0.03 倍,2.79土0.02)但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);VEGF、eNOS蛋白相對(duì)表達(dá)灰度比值均升高(1.86與1.66,0.37與0.09),MCP-1蛋白相對(duì)表達(dá)量則降低(0.30與1.24),ITGB1蛋白相對(duì)表達(dá)量無變化(1.11與1.11)。5.與CSWT組相比,CSWT+SCU30mg/kg組VEGF的mRNA表達(dá)升高(3.03±0.13倍)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),ITGB1的mRNA表達(dá)上調(diào)(5.08±0.13),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001),而eNOS、MCP-1的mRNA表達(dá)降低(0.88±0.02 倍,1.01±0.05 倍);VEGF、eNOS、MCP-1 蛋白相對(duì)表達(dá)灰度比值均升高(1.97與1.66,0.87與0.37,1.45與1.24),ITGB1蛋白相對(duì)表達(dá)量稍降低(1.01與1.11)。6.與 CSWT 組相比,CSWT+SCU90mg/kg 組VEGF、ITGB1 的 mRNA 表達(dá)上調(diào)(5.19±0.66倍,3.17±0.04倍),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而eNOS、MCP-1 的 mRNA 表達(dá)降低(0.43±0.02 倍,0.86±0.04 倍);VEGF、eNOS、MCP-1蛋白相對(duì)表達(dá)灰度比值均升高(2.02與1.66,0.92與0.09,1.70與1.24),ITGB1蛋白相對(duì)表達(dá)量稍降低(1.05與1.11)。[結(jié)論]1.CSWT干預(yù)心肌梗死后SD大鼠可上調(diào)MCP-1表達(dá)水平,但對(duì)eNOS和VEGF表達(dá)水平影響不顯著。2.尚無足夠的證據(jù)支持KCa和整合素-FAK信號(hào)軸是CSWT上調(diào)SD大鼠促動(dòng)脈生成相關(guān)因子機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一部分。3.中藥SCU與CSWT聯(lián)合治療有促進(jìn)急性心肌梗死SD大鼠動(dòng)脈生成協(xié)同效應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R541.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1591905