發(fā)布時間：2018-03-04 08:15

  本文選題：骨髓增生異常綜合征　切入點：成骨細(xì)胞　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:本研究采用細(xì)胞培養(yǎng)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCT)、Westen Blot蛋白質(zhì)免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)等多種實驗技術(shù)和方法檢測骨髓增生異常綜合征(MDS)患者成骨細(xì)胞的數(shù)量、功能及相關(guān)信號通路,初步揭示成骨細(xì)胞在MDS中的異常變化,并進(jìn)一步探索成骨細(xì)胞在MDS造血功能異常機(jī)制中可能的作用。在體外實驗中顯示,MDS患者成骨細(xì)胞數(shù)量減少,功能下降,信號通路異常,對正常干細(xì)胞的數(shù)量、質(zhì)量產(chǎn)生不良影響,可能在MDS發(fā)生、發(fā)展,及其轉(zhuǎn)化為急性髓系白血病中起重要作用。背景:MDS是以老年人為主要發(fā)病人群的造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病,其特點是造血功能低下,轉(zhuǎn)化為急性髓系白血病的風(fēng)險增加。近年來的研究表明,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC),如造血干細(xì)胞(HSC)與惡性克隆異常相互作用,造血細(xì)胞生長因子和細(xì)胞因子異常分泌等的改變,有助于MDS的發(fā)病機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn),間充質(zhì)細(xì)胞在骨髓微環(huán)境,包括成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞和脂肪細(xì)胞,在造血調(diào)控中發(fā)揮重要作用。成骨細(xì)胞是干細(xì)胞早期分化的關(guān)鍵。作為骨髓微環(huán)境的重要組成部分,成骨細(xì)胞在MDS的疾病發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用。材料與方法:本實驗選取2015年9月至2017年2月天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院血液科初治MDS患者38例。所有患者均按照2008版WHO關(guān)于MDS的診斷標(biāo)準(zhǔn),并依據(jù)WPSS評分(表6)將病例組分為Group1(WPSS:0~2分,中低危組)18例和Group2(WPSS:3~6分,高危組)20例。正常對照組25名。應(yīng)用骨髓培養(yǎng)法,體外培養(yǎng)MDS患者成骨細(xì)胞,并檢測其數(shù)量功能。將正常骨髓單個核細(xì)胞分別與MDS患者及正常對照組成骨細(xì)胞混合培養(yǎng)后,檢測HES1、Cyclin D1等信號通路靶基因的變化,并于體外培養(yǎng)干祖細(xì)胞集落,檢測集落形成數(shù)目。磁珠分選正常對照組CD34~+細(xì)胞,分別加入MDS患者及正常對照組成骨細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng),應(yīng)用FCM檢測白血病干細(xì)胞(LSC)細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡比例。應(yīng)用FCM、RT-PCT檢測Jagged1、HES1、Cyclin D1等信號通路中關(guān)鍵基因,ELISA法檢測MDS患者骨髓上清液及成骨細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β的表達(dá)水平,Western blot免疫印跡法檢測成骨細(xì)胞β-catenin/磷酸化β-catenin蛋白水平。探索并初步闡明MDS患者成骨細(xì)胞的異常變化及成骨細(xì)胞在MDS骨髓微環(huán)境中的作用。結(jié)果:第一部分、采用骨髓培養(yǎng)法,條件培養(yǎng)基,在MDS患者骨髓中,可體外培養(yǎng)并純化出成骨細(xì)胞。MDS患者(6.29±6.57%vs13.01±6.29%,p0.05)尤其是高危MDS(5.39±5.96%vs 13.01±6.29%,p0.01),骨髓中成骨祖細(xì)胞數(shù)量較正常對照組減少。高危組MDS患者成骨細(xì)胞數(shù)量(4.62±0.62 vs 6.79±0.79,p0.05)減少。MDS患者(3.61±0.47%vs 6.55±1.46%,p0.05)尤其高危組(2.83±0.44%vs 6.55±1.46%,p0.05)MDS患者成骨細(xì)胞中OCN~+CD34~-LIN~-比例明顯低于正常組,其表達(dá)的骨形成蛋白2(BMP2)較正常對照組(2.51±0.51 vs 4.37±1.14,p0.05)明顯減低。MDS患者正常功能成骨細(xì)胞比例,于其骨髓中原始細(xì)胞呈反比,于其外周血中性粒細(xì)胞絕對值及血紅蛋白濃度呈正比。第二部分、正常骨髓細(xì)胞,分別與MDS患者及正常成骨細(xì)胞共培養(yǎng)后,進(jìn)行干祖細(xì)胞培養(yǎng),MDS組干祖細(xì)胞集落形成較正常組減少,其中CFU-GM形成明顯少于正常組(6.5±3.57 vs 17.9±7.11,p0.01)。MDS組中骨髓細(xì)胞HES1(3.90±1.23 vs 1.72±0.49,p0.05)及CyclinD1(20.24±5.00 vs 6.80±2.85,p0.05)兩個腫瘤相關(guān)基因表達(dá)增高。分選正常人CD34~+細(xì)胞,分別與MDS患者及正常成骨細(xì)胞共培養(yǎng)后,檢測其凋亡MDS組較正常組增高(19.51±5.89%vs5.84±4.15%,p0.001),而LSC比例MDS組明顯增加(6.80±0.89%vs 2.50±1.56%,p0.001)。第三部分、MDS患者成骨細(xì)胞Jagged1(24.34±13.27%vs 12.54±5.89%,p0.05)、RANKL(3.68±2.60 vs 2.24±2.09,p0.05)及HES1(3.23±0.78 vs 1.71±0.44,p0.05)、CyclinD1(6.17±1.34 vs2.02±0.73,p0.05)表達(dá)增高。在培養(yǎng)體系中加入了Notch通路抑制劑DAPT后,其靶基因HES1表達(dá)明顯下降(3.39±0.85 vs0.38±0.15,p0.01),而Wnt通路的靶基因CyclinD1表達(dá)增高(9.15±2.27 vs48.40±6.82,p0.01)。MDS患者骨髓上清(268.98±113.19 vs 366.96±218.64,p0.05)及成骨細(xì)胞培養(yǎng)液中(50.49±27.49 vs 80.54±29.11,p0.05)TGF-β含量較正常降低,治療后,骨髓CR患者的TGF-β含量上升,在骨髓上清中甚至超過了正常對照組的水平(600.21±404.95 vs 366.96±218.64,p0.05)。β-Catenin在MDS患者成骨細(xì)胞中的表達(dá)增高,磷酸化β-Catenin是其活化形式,表達(dá)增高尤其明顯。結(jié)論1、采用骨髓培養(yǎng)法,應(yīng)用條件培養(yǎng)基,在MDS患者骨髓中,可體外培養(yǎng)并純化出成骨細(xì)胞。MDS患者骨髓中成骨祖細(xì)胞數(shù)量較正常對照組減少。MDS患者成骨細(xì)胞數(shù)量減少,成骨能力較正常對照組明顯減低且與臨床指標(biāo)相關(guān)。2、MDS患者成骨細(xì)胞,增加骨髓細(xì)胞中HES1、CyclinD1表達(dá),抑制正常骨髓干祖細(xì)胞的分化增殖,并可誘導(dǎo)惡性克隆性細(xì)胞的產(chǎn)生。3、MDS患者骨髓及成骨細(xì)胞培養(yǎng)液中,TGF-β含量降低,成骨細(xì)胞RANKL、Jagged1及HES1、Cyclin D1表達(dá)增高,β-Catenin表達(dá)增高,相關(guān)信號通路被激活。4、MDS患者成骨細(xì)胞發(fā)生數(shù)量、功能、信號通路的異常變化,并可能因此改變了MDS患者骨髓微環(huán)境。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R551.3

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本文編號：1564854