本文選題：機械牽張力　切入點：血管緊張素轉換酶2　出處：《山東大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：1.研究背景研究報道,心血管疾病已經(jīng)嚴重危害人類健康,并且威脅人類的生命。高血壓是心血管疾病主要危險因素之一。目前,我國高血壓患者已突破3.3億。由高血壓造成的血管結構和功能異常是心血管疾病的主要病理學基礎。高血壓發(fā)生的同時往往伴有血管壁機械牽張力的增加。平滑肌細胞作為機械牽張力的靶細胞,其形態(tài)和功能隨著機械牽張力的升高而發(fā)生改變,從而引起血管形態(tài)和功能的異常。研究認為,機械牽張力刺激血管平滑肌細胞時,機械刺激信號可通過平滑肌細胞表面的各種離子通道、受體分子等轉化為細胞內的生物學信號,進一步影響平滑肌細胞的生物學功能。通常,我們將生理狀態(tài)下血管壁受到的牽張力(9%-12%elongation)稱之為生理性牽張力,可抑制平滑肌細胞的增殖、遷移,維持其收縮表型,維持血管正常的結構和功能；而在高血壓、動脈粥樣硬化等病理情況下,血管壁受到的牽張力升高(15% elongation),我們稱之為病理性牽張力,可促進平滑肌細胞的增殖、遷移,促進血管重構的發(fā)生。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system, RAS)與心血管疾病關系密切。血管緊張素轉化酶(Angiotensin converting enzyme, ACE)可催化血管緊張素Ⅰ(Angiotensin Ⅰ, Ang Ⅰ)產(chǎn)生血管緊張素Ⅱ (Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)。Ang Ⅱ是RAS系統(tǒng)的重要效應分子,與其受體AT1R及AT2R結合發(fā)揮生物學效應。近年來,隨著RAS系統(tǒng)新成員-血管緊張素轉化酶2(ACE2)的發(fā)現(xiàn),為深入研究RAS系統(tǒng)與心血管疾病的關系提供了新思路。ACE2是ACE的同系化合物,其結構與ACE相似,是一種鋅離子依賴的金屬蛋白酶。到目前為止,ACE2主要有兩大生理功能：(1)催化血管緊張素Ⅱ轉化為血管緊張素1-7；(2)催化血管緊張素Ⅰ轉化為血管緊張素1-9,血管緊張素1-9可進一步被ACE降解為血管緊張素1-7。研究表明,血管緊張素1-7是一種與血管緊張素Ⅱ有相反作用的血管緊張素家族的終末活性產(chǎn)物。因而,ACE2被認為是RAS系統(tǒng)的負性調節(jié)因子。研究證明,力學刺激信號可以調節(jié)ACE2的表達,同時ACE2在心血管重構中有保護作用。那么,ACE2在機械牽張力調節(jié)血管平滑肌細胞功能中是否發(fā)揮作用,將是我們重點討論的問題。機械牽張力在調節(jié)血管平滑肌細胞功能中發(fā)揮重要作用,同時ACE2亦參與對平滑肌細胞功能的調節(jié),因而我們提出以下科學假說：(1)周期性牽張力調節(jié)人主動脈平滑肌細胞ACE2的表達；(2)周期性牽張力影響包括ACE2在內的RAS系統(tǒng)各主要成分的表達,ACE2-Ang-(1-7)軸與ACE-Ang Ⅱ軸相互制約、相互影響,共同參與病理性牽張力(18% elongation, 1Hz)對人主動脈平滑肌細胞生物學作用的影響。2.研究目的：(1)探討周期性牽張力對血管平滑肌細胞ACE2表達的影響；(2)明確ACE2在病理性牽張力(18% elongation, 1Hz)調節(jié)人主動脈平滑肌細胞生物學功能中的作用；(3)明確病理性牽張力(18% elongation, 1Hz)調節(jié)血管平滑肌細胞ACE2表達的分子機制。3.研究方法3.1.人主動脈平滑肌細胞(HASMCs)培養(yǎng)與處理3.1.1.平滑肌細胞培養(yǎng)人主動脈平滑肌細胞株購自美國菌種保藏中心ATCC (American Type CellCollection),待平滑肌細胞生長至完全融合后,用吸管吸掉舊培養(yǎng)基,PBS沖洗細胞兩遍,在細胞培養(yǎng)瓶中加入適量事先預熱的0.25%胰蛋白酶,顯微鏡下觀察,至平滑肌細胞變圓后,輕輕拍打至細胞脫落,加入適量完全培養(yǎng)基中和胰酶,吹打細胞,使平滑肌細胞全部掉落,離心5min (1000r/min)。離心結束,用吸管吸掉上清,加入新的完全培養(yǎng)基,轉入新的細胞培養(yǎng)瓶中,將培養(yǎng)瓶放入含5%C02的37℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待平滑肌細胞貼壁完全后,顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及密度。3.1.2.平滑肌細胞干預體外培養(yǎng)的4-7代HASMCs用于實驗。將平滑肌細胞種至鋪有Ⅰ型膠原的Flexcell六孔板中。待平滑肌細胞在六孔板中的密度達到80%-90%時,更換無血清SMCM繼續(xù)培養(yǎng)24小時。牽張力刺激平滑肌細胞前再次更換新的完全培養(yǎng)基。在37。C,5% C02條件下,使用Flexcell 5000-Tension系統(tǒng)刺激平滑肌細胞。不同牽張力描述如下：(1)生理性牽張力:10% elongation,頻率為1Hz；(2)病理性牽張力：18% elongation,頻率為1Hz。3.2.動物模型的建立我們應用大鼠腹主動脈縮窄模擬血管壓力負荷升高,20只雄性Wistar大鼠(200-250g)隨機分為兩組：腹主動脈縮窄組(n=10)和對照組(n=10),分別于術后3、5及7天后取材。3.3.實時熒光定量PCR分析刺激結束后利用Trizol法提取平滑肌細胞中的總RNA,并測定RNA濃度。根據(jù)試劑盒說明,使用TaKaRa公司的cDNA合成試劑盒進行逆轉錄反應,再使用TaKaRa公司的實時定量PCR試劑盒進行PCR反應。反應結束后得到Ct值,用相對定量的方法計算2-△△Ct,并分析數(shù)據(jù)。以測定平滑肌細胞內ACE2及ACE的mRNA表達情況。3.4.蛋白質印跡法(Western Blot)提取不同刺激后的平滑肌細胞及大鼠組織蛋白,4攝氏度離心10分鐘,99攝氏度晃動加熱10分鐘,SDS-PAGE電泳,轉膜,5%脫脂奶粉封閉,4攝氏度一抗孵育過夜,室溫下二抗孵育2小時,ECL化學發(fā)光,利用Photoshop分析對應蛋白條帶的灰度值。3.5.ACE2活性測定刺激結束后,提取平滑肌細胞蛋白,以7-Mca-YVADAPK(Dnp)作為反應底物測定不同刺激條件下ACE2的活性變化情況。3.6.酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)收集不同刺激條件下平滑肌細胞上清液,ELISA法檢測上清中血管緊張素1-7及血管緊張素Ⅱ的含量。3.7.構建含目的基因的病毒載體由上海吉凱基因化學技術有限公司構建過表達ACE2基因腺病毒載體(Ad-ACE2),以攜帶綠色熒光蛋白的腺病毒空載體(Ad-GFP)為對照組。3.8.5-澳脫氧尿嘧啶核苷法(BrdU)用Brdu法檢測ACE2在病理性牽張力(18% elongation,1Hz)調節(jié)HASMCs增殖中的作用。將HASMCs種在Flexcell六孔板中,進行不同刺激。刺激結束后,吸掉舊SMCM,加入適量配制好的BrdU labeling medium作用6小時。將平滑肌細胞用95%7,醇在-20攝氏度固定30分鐘,經(jīng)anti-Brdu working solution4攝氏度孵育過夜、anti-mouse-Ig-fluorescein標記的二抗37攝氏度避光孵育30分鐘,4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-Diaxnidino-2-Phenylindole, DAPI)染核后封片,光學顯微鏡下觀察、拍照。3.9.細胞劃痕實驗用細胞劃痕實驗檢測ACE2在病理性牽張力(18% elongation, 1Hz)調節(jié)HASMCs遷移中的作用。3.10.細胞轉染利用Invitrogen公司的Lipofectamine2000分別轉染不同濃度的Dicer siRNA、 ATF3 siRNA、Negtive control siRNA及miR-421 inhibitor和mimics,觀察ACE2mRNA及蛋白的表達變化,驗證ATF3及miR-421是否參與ACE2表達調節(jié)。DicersiRNA、ATF3 siRNA、Negtive control siRNA及miR-421 inhibitor和miR-421 mimics均由上海吉瑪公司合成。3.11.構建含有ACE2-3'-UTR的熒光素酶報告基因質粒分別構建含有野生型ACE2基因的3'端非編碼區(qū)序列(3'-UTR)和突變型ACE2基因的3'端非編碼區(qū)序列(3'-UTR)的熒光素酶報告基因質粒(pGL3)：ACE2-3'-UTR-WT和ACE2-3'-UTR-MUT。通過Lipofectamine 2000,將miR-421mimics和ACE2-3'-UTR-WT或ACE2-3'-UTR-MUT共轉染人胚腎細胞(Human Embryonic Kidney 293 cells, HEK293),檢測熒光表達強度。明確miR-421與ACE2基因的3端非編碼區(qū)的結合。3.12.組織學染色收集各組大鼠腹主動脈,制備石蠟切片。應用免疫組織化學染色,觀察血管組織內ACE2及ACE的分布及表達情況。3.13.統(tǒng)計學分析實驗所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示,采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。兩組之間的統(tǒng)計分析采用非配對t檢驗,多組之間的統(tǒng)計分析采用單因素方差分析,P0.05代表統(tǒng)計學有顯著性差異。4.結果4.1.周期性牽張力對平滑肌細胞內ACE2、ACE、Ang(1-7)、Ang Ⅱ表達的影響在時間-效應實驗中,18%機械牽張力能夠抑制ACE2的表達,在12小時時間點達到最大抑制效應(p0.01),同時ACE2的活性下降(p0.05)；而18%機械牽張力促進ACE的表達(p0.05),其mRNA于刺激后12小時達到峰值(p0.01)；18%機械牽張力作用3、6小時后,Ang Ⅱ、Ang (1-7)水平比0小時對照組無明顯變化,18%牽張力作用12h后,Ang Ⅱ水平顯著增加(P0.01),而Ang(1-7)水平顯著降低(P0.01),且這一趨勢持續(xù)至機械牽張力刺激24小時。在張力-效應實驗中,與靜止對照組相比,18%機械牽張力刺激12小時后,ACE2表達下降(p0.05)、活性降低(p0.05)；與生理牽張力刺激組相比,18%牽張力刺激12小時后,ACE2表達下降(p0.05)、活性降低(p0.01)。而18%牽張力作用12小時后,其ACE表達比靜止對照組顯著增加(p0.01),比生理牽張力刺激組亦顯著增加(p0.01)。與靜止對照組相比,18%牽張力干預平滑肌細胞12小時后,Ang Ⅱ水平升高明顯(P0.01),而Ang(1-7)水平降低明顯(P0.01)；與生理牽張力刺激組相比,Ang Ⅱ水平亦升高明顯(P0.01),Ang(1-7)水平亦降低明顯(P0.01)。4.2.體內試驗驗證壓力負荷對血管平滑肌細胞ACE2及ACE表達的影響免疫組化結果顯示：與假手術組相比,大鼠腹主動脈縮窄5及7天后,ACE2表達下降(P0.01)；而大鼠腹主動脈縮窄7天后,ACE表達升高(P0.01)。WesternBlot結果顯示：與假手術組相比,大鼠腹主動脈縮窄5及7天后,ACE2表達下降(P0.01)；而ACE表達升高(P0.01)。4.3.ACE2對病理性牽張力調節(jié)平滑肌細胞增殖、遷移及膠原代謝的影響B(tài)rdu摻入法結果提示：與Ad-GFP組相比,Ad-GFP+stretch組促進平滑肌細胞的增殖(P0.01)；與Ad-GFP+stretch組相比,Ad-ACE2+stretch組抑制平滑肌細胞增殖(P0.05)。細胞劃痕試驗表明：與Ad-GFP組相比,Ad-GFP+stretch組促進平滑肌細胞的遷移(P0.01)；與Ad-GFP+stretch組相比,Ad-ACE2+stretch組抑制平滑肌細胞遷移(P0.05)。Westerb Blot結果提示：與Ad-GFP組相比,Ad-GFP+stretch組膠原表達升高(P0.05)；與Ad-GFP+stretch組相比,Ad-ACE2+stretch組膠原表達沒有明顯變化(P0.05)。以上結果表明, ACE2參與病理性牽張力(18% elongation,1Hz)對平滑肌細胞增殖、遷移的調節(jié),但是不參與對膠原代謝的調節(jié)。4.4.p38參與病理性牽張力對ACE2的調節(jié)作用病理性牽張力(18% elongation,1Hz)使得磷酸化p38及磷酸化JNK水平升高(p0.05),而對磷酸化ERK的表達沒有影響(P0.05)。我們應用ERK1/2抑制劑(PD98059)、JNK抑制劑(SP600125)和p38抑制劑(SB203580)干預病理性牽張力(18% elongation,1Hz)刺激。檢測發(fā)現(xiàn)SB203580能夠阻斷病理性牽張力對ACE2的下調作用(P0.05)。表明p38參與病理性牽張力對ACE2表達的調節(jié)。4.5.ATF3參與病理性牽張力對ACE2的調節(jié)作用將ATF3的siRNA轉染入HASMCs中將其沉默,Western Blot結果顯示：與陰性對照組相比,ATF3的干擾可阻斷病理性牽張力對ACE2的下調(P0.01),表明ATF3參與病理性牽張力(18% elongation,1Hz)對ACE2的下調作用。4.6.miR-421參與病理性牽張力對ACE2的調節(jié)作用將Dicer siRNA轉染入HASMCs中沉默Dicer酶后,ACE2表達升高,表明microRNA參與對ACE2表達的調節(jié)。應用TargetScan, microCosm等著名的MicroRNA分析預測軟件,確定ACE2是miR-421的潛在靶基因。轉染miR-421mimics或miR-421 inhibitor后,平滑肌細胞內ACE2的表達水平顯著降低或升高。將miR-421 mimics與ACE2-3'-UTR-WT共轉染HEK293細胞后,熒光強度顯著降低。給予18%牽張力刺激,發(fā)現(xiàn)miR-421水平升高。將平滑肌細胞轉染miR-421mimics后,再給予18%牽張力刺激,發(fā)現(xiàn)ACE2表達水平顯著降低。表明miR-421參與病理性牽張力對ACE2的調節(jié)作用。5.結論(1)病理性牽張力抑制ACE2及Ang(1-7)的表達,促進ACE及Ang Ⅱ的表達；(2)ACE2參與病理性牽張力對平滑肌細胞增殖、遷移的調節(jié),不參與對膠原代謝的調節(jié)；(3) p38、ATF3及miR-421參與病理性牽張力對ACE2的調節(jié)作用。1.研究背景血管一直暴露于血流動力學的作用下,異常的血流動力學,例如血壓增高狀態(tài)下,容易引起血管重構。血管重構主要表現(xiàn)為血管功能、血管管腔面積及形態(tài)、血管壁細胞和細胞外基質的重構。膠原作為細胞外基質的主要成分,其合成和降解過程與血管重構密切相關。4-羥基-脯氨酸羥化酶(Prolyl 4-Hydroxylase,P4H)是膠原合成過程中的關鍵酶,能夠催化位于X-脯氨酸-甘氨酸(X-Pro-Gly)中的脯氨酸變?yōu)榱u脯氨酸,該反應在膠原形成穩(wěn)定三螺旋結構的過程中發(fā)揮重要作用。而P4H由2個α亞基和2個p亞基組成,α亞基是膠原合成過程中的重要限速酶,可決定酶的活性。過表達P4H則導致膠原的合成增多,而抑制P4H的表達會導致膠原的降解和不穩(wěn)定�；|金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)可降解多種細胞外基質成份,其在病理及生理的細胞外基質重塑中起到重要作用。MMPs的活性受到多方面的調節(jié)：轉錄水平調節(jié)、分泌酶原的活化及基質金屬蛋白酶組織抑制劑(Tissue inhibitor of metalloproteases, TIMPs)的抑制。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)病理性牽張力(18% elongation,1HZ)促進人主動脈平滑肌細胞(Human Aortic Smooth Muscle Cells, HASMCs)膠原蛋白的表達,而ACE2 (Angiotensin converting enzyme 2, ACE2)并不參與其中,那么病理性牽張力是否通過P4H和MMPs影響膠原蛋白的代謝?ACE2是否可以影響平滑肌細胞內P4H和MMPs的表達?有待于我們進一步的研究。細胞膜表面的酪氨酸激酶受體(Receptor tyrosine kinase, RTKs)、整合素(Integrin)、離子通道等結構均可以將胞外力學刺激轉化為胞內生化信號,激活PI3K/Akt、MAPKs、PKC等多種信號分子,活化多種轉錄因子,通過改變細胞增殖、調亡、表型轉化、細胞外基質代謝等有關基因的表達而影響細胞功能。前期研究發(fā)現(xiàn),PI3K/Akt通路參與血管平滑肌細胞MMP-2的表達。機械牽張力通過MAPKs信號通路調節(jié)血管平滑肌細胞的不同功能。我們實驗室發(fā)現(xiàn),ox-LDL通過p38和ERK 1/2抑制P4Hα1的表達,ASK1-JNK通路參與腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor, TNF)對P4Hα1的抑制作用。那么病理性牽張力是否通過PI3K/Akt和MAPKs信號通路調節(jié)HASMCs MMPs及P4H的表達,尚需要進一步的明確。為了觀察高血壓狀態(tài)下血管壁膠原的重構過程,我們研究了病理性牽張力(18%elongation,1HZ)引起MMPs和P4H的變化及相關機制,探討了病理性牽張力對膠原代謝的影響。2.研究目的：(1)探討周期性牽張力對血管平滑肌細胞P4Hα1、MMPs、TMP-1、TIMP-2及膠原表達的影響；(2)明確病理性牽張力(18% elongation,1 HZ)調節(jié)血管平滑肌細胞P4Hα1及MMP-2表達的分子機制；(3)研究ACE2對血管平滑肌細胞P4Hα1、MMP-2表達的影響。3.研究方法：3.1.人主動脈平滑肌細胞(HASMCs)培養(yǎng)人主動脈平滑肌細胞株購自美國菌種保藏中心(ATCC),待平滑肌細胞生長至完全融合后,用吸管吸掉舊SMCM,PBS沖洗細胞兩遍后,在細胞培養(yǎng)瓶中加入事先預熱的0.25%胰蛋白酶,擰緊瓶蓋,顯微鏡下觀察,待平滑肌細胞變圓后,輕輕震蕩至細胞脫落,加入適量培養(yǎng)基中和胰酶,吹打細胞,使平滑肌細胞掉落,移至離心管中,離心5min (1000r/min)。離心結束,棄掉上清,加入新的完全培養(yǎng)基,轉入新的培養(yǎng)瓶放入含5% C02的37℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第4-7代HASMCs用于實驗。3.2.平滑肌細胞處理體外培養(yǎng)的4-7代HASMCs用于實驗。將平滑肌細胞種至鋪有Ⅰ型膠原的Flexcell六孔板中。待平滑肌細胞在六孔板中的密度達到800%-90%時,更換無血清SMCM繼續(xù)培養(yǎng)24小時。牽張力刺激平滑肌細胞前再次更換新的完全培養(yǎng)基。在37。C,5%C02條件下,使用Flexcell 5000-Tension系統(tǒng)刺激平滑肌細胞。不同牽張力描述如下：(1)生理性牽張力：10% elongation,頻率為1Hz；(2)病理性牽張力：18% elongation,頻率為1Hz。3.3.動物模型的建立20只雄性Wistar大鼠(200-250g)隨機分為兩組：腹主動脈縮窄組(n=10)和對照組(n=10)。分別于術后3、5、7天取材。3.4.實時熒光定量PCR分析刺激結束后利用Trizol法提取細胞中的總RNA,用紫外分光光度儀測定RNA濃度。根據(jù)TaKaRa公司的試劑盒操作說明,使用cDNA合成試劑盒進行逆轉錄反應,再使用TaKaRa公司的實時定量PCR試劑盒進行PCR反應。反應結束得到Ct值,用相對定量的方法計算2-△△Ct,并分析數(shù)據(jù)。以測定P4Hα1、MMP-2、 TIMP-1及TIMP-2的mRNA表達情況。3.5.蛋白質印跡法(Western Blot)提取不同刺激后的細胞或組織蛋白,4℃離心10分鐘,99℃晃動加熱10分鐘,SDS-PAGE電泳,轉膜,5%脫脂奶粉封閉,4℃一抗孵育過夜,室溫下二抗孵育2小時,化學發(fā)光,分析對應的蛋白條帶的灰度值。3.6.酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)刺激結束后,收集平滑肌細胞上清,ELISA檢測其中Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量。3.7.明膠酶譜采用明膠酶譜法檢測HASMCs及大鼠血管平滑肌細胞中MMP-2和MMP-9的活性。3.8.組織學染色收集各組大鼠腹主動脈,制備石蠟切片,進行Masson染色,顯示血管壁膠原的含量。應用免疫組織化學染色,觀察血管組織內P4Hα1、MMPs、TIMP-1及TIMP-2的分布及表達情況。3.9.統(tǒng)計學分析實驗所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示,采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。兩組之間的統(tǒng)計分析采用非配對t檢驗,多組之間的統(tǒng)計分析采用單因素方差分析,P0.05代表統(tǒng)計學有顯著性差異。4.研究結果4.1.病理性牽張力對人主動脈平滑肌細胞內P4Hα1、MMPs及TIMPs表達的影響在時間-效應實驗中,病理性牽張力(18% elongation,1HZ)能夠促進P4Hα1的表達,在12小時時間點達峰(p0.05)。明膠酶譜法檢測MMPs的活性,發(fā)現(xiàn)18%牽張力刺激可以增加HASMCs中MMP-2的活性(p0.05),但在該實驗中未能檢測出MMP-9的活性。RT-PCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn),病理性牽張力能夠促進MMP-2的表達(p0.05)。而病理性牽張力刺激對TIMP-1及TIMP-2的表達沒有明顯影響(p0.05)。在張力-效應實驗中,與靜止對照組及生理牽張力刺激組相比,病理性牽張力刺激12小時后,P4Hα1顯著升高(p0.01)。應用明膠酶譜法檢測,10%及18%牽張力均能升高平滑肌細胞內MMP-2的活性(p0.01),而與10%牽張力組相比,18%牽張力升高MMP-2活性的程度更為明顯(p0.01)。RT-PCR及Westernblot結果提示,與靜止對照組及生理牽張力刺激組相比,18%機械牽張力能夠促進MMP-2的表達(p0.05)。同樣,10%及18%牽張力刺激平滑肌細胞12小時后,平滑肌細胞內TIMP-1及TIMP-2的表達沒有明顯影響(p0.05)。4.2.病理性牽張力對人主動脈平滑肌細胞內膠原表達的影響應用ELISA及Western blot檢測平滑肌細胞內膠原蛋白的表達水平。結果提示,病理性牽張力(18% elongation,1Hz)刺激平滑肌細胞12小時后,膠原Ⅰ及膠原Ⅲ的表達水平顯著升高(p0.05)。4.3.MMP-2及P4Ha1參與病理性牽張力對膠原代謝的影響我們應用siRNA干擾MMP-2及P4Ha1的表達,發(fā)現(xiàn)MMP-2 siRNA及P4Hα1siRNA能升高或降低病理性牽張力(18% elongation,1Hz)引起的膠原蛋白的表達,證明在病理性牽張力作用下,MMP-2及P4Hα1參與對膠原的調節(jié)。4.4.體內試驗驗證壓力負荷對血管平滑肌細胞P4Hα1、MMPs、TIMPs及膠原表達的影響應用明膠酶譜法檢測發(fā)現(xiàn),大鼠腹主動脈縮窄7天后MMP-2的活性顯著增加(p0.05),但未能檢測出MMP-9的活性。免疫組化及Western blot結果顯示：與假手術組相比,大鼠腹主動脈縮窄后,P4Ha1及MMP-2表達升高(p0.05),而TIMP-1及TIMP-2的表達沒有明顯變化(p0.05)。應用Mssson染色及Western blot檢測壓力負荷增加對膠原蛋白的影響,結果提示大鼠腹主動脈縮窄后血管內膠原含量增加(p0.05)。4.5.Akt在病理性牽張力調節(jié)平滑肌細胞MMP-2及P4Ha1表達中的作用病理性牽張力(18% elongation,1Hz)使得磷酸化Akt水平升高(p0.05)。給予平滑肌細胞Akt抑制劑LY294002預處理1小時,然后給予18%牽張力刺激12小時,發(fā)現(xiàn)LY294002預處理可降低病理性牽張力誘導的MMP-2表達上調及活性升高(P0.05),卻并不降低牽張力誘導的P4Hα1表達上調(P0.05)。表明Akt參與病理性牽張力對MMP-2表達的調節(jié),不參與對病理性牽張力對P4Hα1表達的調節(jié)。4.6. MAPKs在病理性牽張力調節(jié)平滑肌細胞MMP-2及P4Ha1表達中的作用病理性牽張力(18% elongation,1Hz)使得磷酸化p38及磷酸化JNK水平升高(p0.05),而對磷酸化ERK的表達沒有影響(P0.05)。我們應用MAPKs的抑制劑SB203580、SP600125和PD98059干預病理性牽張力(18% elongation,1Hz)刺激。檢測發(fā)現(xiàn)SB203580、SP600125和PD98059對病理性牽張力促進MMP-2表達的作用沒有明顯影響(P0.05),對升高MMP-2活性的作用亦沒有明顯影響(P0.05)。然而,SB203580和SP600125能夠阻斷病理性牽張力對P4Hα1的上調作用(P0.01)。表明MAPKs不參與病理性牽張力對MMP-2表達的調節(jié),p38和JNK參與病理性牽張力對P4Hα1表達的調節(jié)。4.7ACE2對MMP-2及P4Ha1表達的影響我們前期研究發(fā)現(xiàn),ACE2不參與病理性牽張力(18% elongation,1Hz)對膠原代謝的調節(jié)。而MMP-2和P4Hα1參與病理性牽張力對膠原代謝的影響。本研究探討了ACE2對MMP-2及P4Hα1表達的影響。應用siRNA干擾ACE2的表達,發(fā)現(xiàn)ACE2 siRNA對平滑肌細胞內MMP-2和P4Hαl的表達沒有明顯影響(P0.05),進一步表明了ACE2不參與病理性牽張力對膠原代謝調節(jié)的作用。5.結論(1)病理性牽張力(18% elongation,1Hz)上調P4Hα1、MMP-2及膠原的表達,對TMP-1和TIMP-2的表達沒有影響；(2)18%牽張力通過激活Akt和p38 MAPK-JNK信號通路促進MMP-2、 P4Hα1的表達。(3)MMP-2及P4Hα1參與病理性牽張力對膠原代謝的影響,ACE2不參與病理性牽張力對膠原代謝的影響,且ACE2對不影響平滑肌細胞內MMP-2和P4Hal的表達。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54
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本文編號：1559734