本文選題：機(jī)械牽張力　切入點(diǎn)：血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：1.研究背景研究報(bào)道,心血管疾病已經(jīng)嚴(yán)重危害人類健康,并且威脅人類的生命。高血壓是心血管疾病主要危險(xiǎn)因素之一。目前,我國高血壓患者已突破3.3億。由高血壓造成的血管結(jié)構(gòu)和功能異常是心血管疾病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)。高血壓發(fā)生的同時(shí)往往伴有血管壁機(jī)械牽張力的增加。平滑肌細(xì)胞作為機(jī)械牽張力的靶細(xì)胞,其形態(tài)和功能隨著機(jī)械牽張力的升高而發(fā)生改變,從而引起血管形態(tài)和功能的異常。研究認(rèn)為,機(jī)械牽張力刺激血管平滑肌細(xì)胞時(shí),機(jī)械刺激信號(hào)可通過平滑肌細(xì)胞表面的各種離子通道、受體分子等轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)信號(hào),進(jìn)一步影響平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)功能。通常,我們將生理狀態(tài)下血管壁受到的牽張力(9%-12%elongation)稱之為生理性牽張力,可抑制平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移,維持其收縮表型,維持血管正常的結(jié)構(gòu)和功能；而在高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等病理情況下,血管壁受到的牽張力升高(15% elongation),我們稱之為病理性牽張力,可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移,促進(jìn)血管重構(gòu)的發(fā)生。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system, RAS)與心血管疾病關(guān)系密切。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin converting enzyme, ACE)可催化血管緊張素Ⅰ(Angiotensin Ⅰ, Ang Ⅰ)產(chǎn)生血管緊張素Ⅱ (Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)。Ang Ⅱ是RAS系統(tǒng)的重要效應(yīng)分子,與其受體AT1R及AT2R結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。近年來,隨著RAS系統(tǒng)新成員-血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)的發(fā)現(xiàn),為深入研究RAS系統(tǒng)與心血管疾病的關(guān)系提供了新思路。ACE2是ACE的同系化合物,其結(jié)構(gòu)與ACE相似,是一種鋅離子依賴的金屬蛋白酶。到目前為止,ACE2主要有兩大生理功能：(1)催化血管緊張素Ⅱ轉(zhuǎn)化為血管緊張素1-7；(2)催化血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張素1-9,血管緊張素1-9可進(jìn)一步被ACE降解為血管緊張素1-7。研究表明,血管緊張素1-7是一種與血管緊張素Ⅱ有相反作用的血管緊張素家族的終末活性產(chǎn)物。因而,ACE2被認(rèn)為是RAS系統(tǒng)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。研究證明,力學(xué)刺激信號(hào)可以調(diào)節(jié)ACE2的表達(dá),同時(shí)ACE2在心血管重構(gòu)中有保護(hù)作用。那么,ACE2在機(jī)械牽張力調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞功能中是否發(fā)揮作用,將是我們重點(diǎn)討論的問題。機(jī)械牽張力在調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用,同時(shí)ACE2亦參與對(duì)平滑肌細(xì)胞功能的調(diào)節(jié),因而我們提出以下科學(xué)假說：(1)周期性牽張力調(diào)節(jié)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞ACE2的表達(dá)；(2)周期性牽張力影響包括ACE2在內(nèi)的RAS系統(tǒng)各主要成分的表達(dá),ACE2-Ang-(1-7)軸與ACE-Ang Ⅱ軸相互制約、相互影響,共同參與病理性牽張力(18% elongation, 1Hz)對(duì)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞生物學(xué)作用的影響。2.研究目的：(1)探討周期性牽張力對(duì)血管平滑肌細(xì)胞ACE2表達(dá)的影響；(2)明確ACE2在病理性牽張力(18% elongation, 1Hz)調(diào)節(jié)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用；(3)明確病理性牽張力(18% elongation, 1Hz)調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞ACE2表達(dá)的分子機(jī)制。3.研究方法3.1.人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs)培養(yǎng)與處理3.1.1.平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株購自美國菌種保藏中心ATCC (American Type CellCollection),待平滑肌細(xì)胞生長至完全融合后,用吸管吸掉舊培養(yǎng)基,PBS沖洗細(xì)胞兩遍,在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入適量事先預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶,顯微鏡下觀察,至平滑肌細(xì)胞變圓后,輕輕拍打至細(xì)胞脫落,加入適量完全培養(yǎng)基中和胰酶,吹打細(xì)胞,使平滑肌細(xì)胞全部掉落,離心5min (1000r/min)。離心結(jié)束,用吸管吸掉上清,加入新的完全培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)入新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,將培養(yǎng)瓶放入含5%C02的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待平滑肌細(xì)胞貼壁完全后,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及密度。3.1.2.平滑肌細(xì)胞干預(yù)體外培養(yǎng)的4-7代HASMCs用于實(shí)驗(yàn)。將平滑肌細(xì)胞種至鋪有Ⅰ型膠原的Flexcell六孔板中。待平滑肌細(xì)胞在六孔板中的密度達(dá)到80%-90%時(shí),更換無血清SMCM繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。牽張力刺激平滑肌細(xì)胞前再次更換新的完全培養(yǎng)基。在37。C,5% C02條件下,使用Flexcell 5000-Tension系統(tǒng)刺激平滑肌細(xì)胞。不同牽張力描述如下：(1)生理性牽張力:10% elongation,頻率為1Hz；(2)病理性牽張力：18% elongation,頻率為1Hz。3.2.動(dòng)物模型的建立我們應(yīng)用大鼠腹主動(dòng)脈縮窄模擬血管壓力負(fù)荷升高,20只雄性Wistar大鼠(200-250g)隨機(jī)分為兩組：腹主動(dòng)脈縮窄組(n=10)和對(duì)照組(n=10),分別于術(shù)后3、5及7天后取材。3.3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析刺激結(jié)束后利用Trizol法提取平滑肌細(xì)胞中的總RNA,并測(cè)定RNA濃度。根據(jù)試劑盒說明,使用TaKaRa公司的cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),再使用TaKaRa公司的實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后得到Ct值,用相對(duì)定量的方法計(jì)算2-△△Ct,并分析數(shù)據(jù)。以測(cè)定平滑肌細(xì)胞內(nèi)ACE2及ACE的mRNA表達(dá)情況。3.4.蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)提取不同刺激后的平滑肌細(xì)胞及大鼠組織蛋白,4攝氏度離心10分鐘,99攝氏度晃動(dòng)加熱10分鐘,SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉,4攝氏度一抗孵育過夜,室溫下二抗孵育2小時(shí),ECL化學(xué)發(fā)光,利用Photoshop分析對(duì)應(yīng)蛋白條帶的灰度值。3.5.ACE2活性測(cè)定刺激結(jié)束后,提取平滑肌細(xì)胞蛋白,以7-Mca-YVADAPK(Dnp)作為反應(yīng)底物測(cè)定不同刺激條件下ACE2的活性變化情況。3.6.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)收集不同刺激條件下平滑肌細(xì)胞上清液,ELISA法檢測(cè)上清中血管緊張素1-7及血管緊張素Ⅱ的含量。3.7.構(gòu)建含目的基因的病毒載體由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建過表達(dá)ACE2基因腺病毒載體(Ad-ACE2),以攜帶綠色熒光蛋白的腺病毒空載體(Ad-GFP)為對(duì)照組。3.8.5-澳脫氧尿嘧啶核苷法(BrdU)用Brdu法檢測(cè)ACE2在病理性牽張力(18% elongation,1Hz)調(diào)節(jié)HASMCs增殖中的作用。將HASMCs種在Flexcell六孔板中,進(jìn)行不同刺激。刺激結(jié)束后,吸掉舊SMCM,加入適量配制好的BrdU labeling medium作用6小時(shí)。將平滑肌細(xì)胞用95%7,醇在-20攝氏度固定30分鐘,經(jīng)anti-Brdu working solution4攝氏度孵育過夜、anti-mouse-Ig-fluorescein標(biāo)記的二抗37攝氏度避光孵育30分鐘,4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-Diaxnidino-2-Phenylindole, DAPI)染核后封片,光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。3.9.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ACE2在病理性牽張力(18% elongation, 1Hz)調(diào)節(jié)HASMCs遷移中的作用。3.10.細(xì)胞轉(zhuǎn)染利用Invitrogen公司的Lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)染不同濃度的Dicer siRNA、 ATF3 siRNA、Negtive control siRNA及miR-421 inhibitor和mimics,觀察ACE2mRNA及蛋白的表達(dá)變化,驗(yàn)證ATF3及miR-421是否參與ACE2表達(dá)調(diào)節(jié)。DicersiRNA、ATF3 siRNA、Negtive control siRNA及miR-421 inhibitor和miR-421 mimics均由上海吉瑪公司合成。3.11.構(gòu)建含有ACE2-3'-UTR的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒分別構(gòu)建含有野生型ACE2基因的3'端非編碼區(qū)序列(3'-UTR)和突變型ACE2基因的3'端非編碼區(qū)序列(3'-UTR)的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(pGL3)：ACE2-3'-UTR-WT和ACE2-3'-UTR-MUT。通過Lipofectamine 2000,將miR-421mimics和ACE2-3'-UTR-WT或ACE2-3'-UTR-MUT共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞(Human Embryonic Kidney 293 cells, HEK293),檢測(cè)熒光表達(dá)強(qiáng)度。明確miR-421與ACE2基因的3端非編碼區(qū)的結(jié)合。3.12.組織學(xué)染色收集各組大鼠腹主動(dòng)脈,制備石蠟切片。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色,觀察血管組織內(nèi)ACE2及ACE的分布及表達(dá)情況。3.13.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組之間的統(tǒng)計(jì)分析采用非配對(duì)t檢驗(yàn),多組之間的統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析,P0.05代表統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異。4.結(jié)果4.1.周期性牽張力對(duì)平滑肌細(xì)胞內(nèi)ACE2、ACE、Ang(1-7)、Ang Ⅱ表達(dá)的影響在時(shí)間-效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中,18%機(jī)械牽張力能夠抑制ACE2的表達(dá),在12小時(shí)時(shí)間點(diǎn)達(dá)到最大抑制效應(yīng)(p0.01),同時(shí)ACE2的活性下降(p0.05)；而18%機(jī)械牽張力促進(jìn)ACE的表達(dá)(p0.05),其mRNA于刺激后12小時(shí)達(dá)到峰值(p0.01)；18%機(jī)械牽張力作用3、6小時(shí)后,Ang Ⅱ、Ang (1-7)水平比0小時(shí)對(duì)照組無明顯變化,18%牽張力作用12h后,Ang Ⅱ水平顯著增加(P0.01),而Ang(1-7)水平顯著降低(P0.01),且這一趨勢(shì)持續(xù)至機(jī)械牽張力刺激24小時(shí)。在張力-效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中,與靜止對(duì)照組相比,18%機(jī)械牽張力刺激12小時(shí)后,ACE2表達(dá)下降(p0.05)、活性降低(p0.05)；與生理牽張力刺激組相比,18%牽張力刺激12小時(shí)后,ACE2表達(dá)下降(p0.05)、活性降低(p0.01)。而18%牽張力作用12小時(shí)后,其ACE表達(dá)比靜止對(duì)照組顯著增加(p0.01),比生理牽張力刺激組亦顯著增加(p0.01)。與靜止對(duì)照組相比,18%牽張力干預(yù)平滑肌細(xì)胞12小時(shí)后,Ang Ⅱ水平升高明顯(P0.01),而Ang(1-7)水平降低明顯(P0.01)；與生理牽張力刺激組相比,Ang Ⅱ水平亦升高明顯(P0.01),Ang(1-7)水平亦降低明顯(P0.01)。4.2.體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證壓力負(fù)荷對(duì)血管平滑肌細(xì)胞ACE2及ACE表達(dá)的影響免疫組化結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比,大鼠腹主動(dòng)脈縮窄5及7天后,ACE2表達(dá)下降(P0.01)；而大鼠腹主動(dòng)脈縮窄7天后,ACE表達(dá)升高(P0.01)。WesternBlot結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比,大鼠腹主動(dòng)脈縮窄5及7天后,ACE2表達(dá)下降(P0.01)；而ACE表達(dá)升高(P0.01)。4.3.ACE2對(duì)病理性牽張力調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及膠原代謝的影響B(tài)rdu摻入法結(jié)果提示：與Ad-GFP組相比,Ad-GFP+stretch組促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖(P0.01)；與Ad-GFP+stretch組相比,Ad-ACE2+stretch組抑制平滑肌細(xì)胞增殖(P0.05)。細(xì)胞劃痕試驗(yàn)表明：與Ad-GFP組相比,Ad-GFP+stretch組促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的遷移(P0.01)；與Ad-GFP+stretch組相比,Ad-ACE2+stretch組抑制平滑肌細(xì)胞遷移(P0.05)。Westerb Blot結(jié)果提示：與Ad-GFP組相比,Ad-GFP+stretch組膠原表達(dá)升高(P0.05)；與Ad-GFP+stretch組相比,Ad-ACE2+stretch組膠原表達(dá)沒有明顯變化(P0.05)。以上結(jié)果表明, ACE2參與病理性牽張力(18% elongation,1Hz)對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的調(diào)節(jié),但是不參與對(duì)膠原代謝的調(diào)節(jié)。4.4.p38參與病理性牽張力對(duì)ACE2的調(diào)節(jié)作用病理性牽張力(18% elongation,1Hz)使得磷酸化p38及磷酸化JNK水平升高(p0.05),而對(duì)磷酸化ERK的表達(dá)沒有影響(P0.05)。我們應(yīng)用ERK1/2抑制劑(PD98059)、JNK抑制劑(SP600125)和p38抑制劑(SB203580)干預(yù)病理性牽張力(18% elongation,1Hz)刺激。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SB203580能夠阻斷病理性牽張力對(duì)ACE2的下調(diào)作用(P0.05)。表明p38參與病理性牽張力對(duì)ACE2表達(dá)的調(diào)節(jié)。4.5.ATF3參與病理性牽張力對(duì)ACE2的調(diào)節(jié)作用將ATF3的siRNA轉(zhuǎn)染入HASMCs中將其沉默,Western Blot結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組相比,ATF3的干擾可阻斷病理性牽張力對(duì)ACE2的下調(diào)(P0.01),表明ATF3參與病理性牽張力(18% elongation,1Hz)對(duì)ACE2的下調(diào)作用。4.6.miR-421參與病理性牽張力對(duì)ACE2的調(diào)節(jié)作用將Dicer siRNA轉(zhuǎn)染入HASMCs中沉默Dicer酶后,ACE2表達(dá)升高,表明microRNA參與對(duì)ACE2表達(dá)的調(diào)節(jié)。應(yīng)用TargetScan, microCosm等著名的MicroRNA分析預(yù)測(cè)軟件,確定ACE2是miR-421的潛在靶基因。轉(zhuǎn)染miR-421mimics或miR-421 inhibitor后,平滑肌細(xì)胞內(nèi)ACE2的表達(dá)水平顯著降低或升高。將miR-421 mimics與ACE2-3'-UTR-WT共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后,熒光強(qiáng)度顯著降低。給予18%牽張力刺激,發(fā)現(xiàn)miR-421水平升高。將平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-421mimics后,再給予18%牽張力刺激,發(fā)現(xiàn)ACE2表達(dá)水平顯著降低。表明miR-421參與病理性牽張力對(duì)ACE2的調(diào)節(jié)作用。5.結(jié)論(1)病理性牽張力抑制ACE2及Ang(1-7)的表達(dá),促進(jìn)ACE及Ang Ⅱ的表達(dá)；(2)ACE2參與病理性牽張力對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的調(diào)節(jié),不參與對(duì)膠原代謝的調(diào)節(jié)；(3) p38、ATF3及miR-421參與病理性牽張力對(duì)ACE2的調(diào)節(jié)作用。1.研究背景血管一直暴露于血流動(dòng)力學(xué)的作用下,異常的血流動(dòng)力學(xué),例如血壓增高狀態(tài)下,容易引起血管重構(gòu)。血管重構(gòu)主要表現(xiàn)為血管功能、血管管腔面積及形態(tài)、血管壁細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的重構(gòu)。膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,其合成和降解過程與血管重構(gòu)密切相關(guān)。4-羥基-脯氨酸羥化酶(Prolyl 4-Hydroxylase,P4H)是膠原合成過程中的關(guān)鍵酶,能夠催化位于X-脯氨酸-甘氨酸(X-Pro-Gly)中的脯氨酸變?yōu)榱u脯氨酸,該反應(yīng)在膠原形成穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)的過程中發(fā)揮重要作用。而P4H由2個(gè)α亞基和2個(gè)p亞基組成,α亞基是膠原合成過程中的重要限速酶,可決定酶的活性。過表達(dá)P4H則導(dǎo)致膠原的合成增多,而抑制P4H的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致膠原的降解和不穩(wěn)定。基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)可降解多種細(xì)胞外基質(zhì)成份,其在病理及生理的細(xì)胞外基質(zhì)重塑中起到重要作用。MMPs的活性受到多方面的調(diào)節(jié)：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)、分泌酶原的活化及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(Tissue inhibitor of metalloproteases, TIMPs)的抑制。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)病理性牽張力(18% elongation,1HZ)促進(jìn)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(Human Aortic Smooth Muscle Cells, HASMCs)膠原蛋白的表達(dá),而ACE2 (Angiotensin converting enzyme 2, ACE2)并不參與其中,那么病理性牽張力是否通過P4H和MMPs影響膠原蛋白的代謝?ACE2是否可以影響平滑肌細(xì)胞內(nèi)P4H和MMPs的表達(dá)?有待于我們進(jìn)一步的研究。細(xì)胞膜表面的酪氨酸激酶受體(Receptor tyrosine kinase, RTKs)、整合素(Integrin)、離子通道等結(jié)構(gòu)均可以將胞外力學(xué)刺激轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)生化信號(hào),激活PI3K/Akt、MAPKs、PKC等多種信號(hào)分子,活化多種轉(zhuǎn)錄因子,通過改變細(xì)胞增殖、調(diào)亡、表型轉(zhuǎn)化、細(xì)胞外基質(zhì)代謝等有關(guān)基因的表達(dá)而影響細(xì)胞功能。前期研究發(fā)現(xiàn),PI3K/Akt通路參與血管平滑肌細(xì)胞MMP-2的表達(dá)。機(jī)械牽張力通過MAPKs信號(hào)通路調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的不同功能。我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn),ox-LDL通過p38和ERK 1/2抑制P4Hα1的表達(dá),ASK1-JNK通路參與腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor, TNF)對(duì)P4Hα1的抑制作用。那么病理性牽張力是否通過PI3K/Akt和MAPKs信號(hào)通路調(diào)節(jié)HASMCs MMPs及P4H的表達(dá),尚需要進(jìn)一步的明確。為了觀察高血壓狀態(tài)下血管壁膠原的重構(gòu)過程,我們研究了病理性牽張力(18%elongation,1HZ)引起MMPs和P4H的變化及相關(guān)機(jī)制,探討了病理性牽張力對(duì)膠原代謝的影響。2.研究目的：(1)探討周期性牽張力對(duì)血管平滑肌細(xì)胞P4Hα1、MMPs、TMP-1、TIMP-2及膠原表達(dá)的影響；(2)明確病理性牽張力(18% elongation,1 HZ)調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞P4Hα1及MMP-2表達(dá)的分子機(jī)制；(3)研究ACE2對(duì)血管平滑肌細(xì)胞P4Hα1、MMP-2表達(dá)的影響。3.研究方法：3.1.人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs)培養(yǎng)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株購自美國菌種保藏中心(ATCC),待平滑肌細(xì)胞生長至完全融合后,用吸管吸掉舊SMCM,PBS沖洗細(xì)胞兩遍后,在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入事先預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶,擰緊瓶蓋,顯微鏡下觀察,待平滑肌細(xì)胞變圓后,輕輕震蕩至細(xì)胞脫落,加入適量培養(yǎng)基中和胰酶,吹打細(xì)胞,使平滑肌細(xì)胞掉落,移至離心管中,離心5min (1000r/min)。離心結(jié)束,棄掉上清,加入新的完全培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶放入含5% C02的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第4-7代HASMCs用于實(shí)驗(yàn)。3.2.平滑肌細(xì)胞處理體外培養(yǎng)的4-7代HASMCs用于實(shí)驗(yàn)。將平滑肌細(xì)胞種至鋪有Ⅰ型膠原的Flexcell六孔板中。待平滑肌細(xì)胞在六孔板中的密度達(dá)到800%-90%時(shí),更換無血清SMCM繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。牽張力刺激平滑肌細(xì)胞前再次更換新的完全培養(yǎng)基。在37。C,5%C02條件下,使用Flexcell 5000-Tension系統(tǒng)刺激平滑肌細(xì)胞。不同牽張力描述如下：(1)生理性牽張力：10% elongation,頻率為1Hz；(2)病理性牽張力：18% elongation,頻率為1Hz。3.3.動(dòng)物模型的建立20只雄性Wistar大鼠(200-250g)隨機(jī)分為兩組：腹主動(dòng)脈縮窄組(n=10)和對(duì)照組(n=10)。分別于術(shù)后3、5、7天取材。3.4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析刺激結(jié)束后利用Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA,用紫外分光光度儀測(cè)定RNA濃度。根據(jù)TaKaRa公司的試劑盒操作說明,使用cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),再使用TaKaRa公司的實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束得到Ct值,用相對(duì)定量的方法計(jì)算2-△△Ct,并分析數(shù)據(jù)。以測(cè)定P4Hα1、MMP-2、 TIMP-1及TIMP-2的mRNA表達(dá)情況。3.5.蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)提取不同刺激后的細(xì)胞或組織蛋白,4℃離心10分鐘,99℃晃動(dòng)加熱10分鐘,SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉,4℃一抗孵育過夜,室溫下二抗孵育2小時(shí),化學(xué)發(fā)光,分析對(duì)應(yīng)的蛋白條帶的灰度值。3.6.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)刺激結(jié)束后,收集平滑肌細(xì)胞上清,ELISA檢測(cè)其中Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量。3.7.明膠酶譜采用明膠酶譜法檢測(cè)HASMCs及大鼠血管平滑肌細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的活性。3.8.組織學(xué)染色收集各組大鼠腹主動(dòng)脈,制備石蠟切片,進(jìn)行Masson染色,顯示血管壁膠原的含量。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色,觀察血管組織內(nèi)P4Hα1、MMPs、TIMP-1及TIMP-2的分布及表達(dá)情況。3.9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組之間的統(tǒng)計(jì)分析采用非配對(duì)t檢驗(yàn),多組之間的統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析,P0.05代表統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異。4.研究結(jié)果4.1.病理性牽張力對(duì)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)P4Hα1、MMPs及TIMPs表達(dá)的影響在時(shí)間-效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中,病理性牽張力(18% elongation,1HZ)能夠促進(jìn)P4Hα1的表達(dá),在12小時(shí)時(shí)間點(diǎn)達(dá)峰(p0.05)。明膠酶譜法檢測(cè)MMPs的活性,發(fā)現(xiàn)18%牽張力刺激可以增加HASMCs中MMP-2的活性(p0.05),但在該實(shí)驗(yàn)中未能檢測(cè)出MMP-9的活性。RT-PCR及Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),病理性牽張力能夠促進(jìn)MMP-2的表達(dá)(p0.05)。而病理性牽張力刺激對(duì)TIMP-1及TIMP-2的表達(dá)沒有明顯影響(p0.05)。在張力-效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中,與靜止對(duì)照組及生理牽張力刺激組相比,病理性牽張力刺激12小時(shí)后,P4Hα1顯著升高(p0.01)。應(yīng)用明膠酶譜法檢測(cè),10%及18%牽張力均能升高平滑肌細(xì)胞內(nèi)MMP-2的活性(p0.01),而與10%牽張力組相比,18%牽張力升高M(jìn)MP-2活性的程度更為明顯(p0.01)。RT-PCR及Westernblot結(jié)果提示,與靜止對(duì)照組及生理牽張力刺激組相比,18%機(jī)械牽張力能夠促進(jìn)MMP-2的表達(dá)(p0.05)。同樣,10%及18%牽張力刺激平滑肌細(xì)胞12小時(shí)后,平滑肌細(xì)胞內(nèi)TIMP-1及TIMP-2的表達(dá)沒有明顯影響(p0.05)。4.2.病理性牽張力對(duì)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)膠原表達(dá)的影響應(yīng)用ELISA及Western blot檢測(cè)平滑肌細(xì)胞內(nèi)膠原蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果提示,病理性牽張力(18% elongation,1Hz)刺激平滑肌細(xì)胞12小時(shí)后,膠原Ⅰ及膠原Ⅲ的表達(dá)水平顯著升高(p0.05)。4.3.MMP-2及P4Ha1參與病理性牽張力對(duì)膠原代謝的影響我們應(yīng)用siRNA干擾MMP-2及P4Ha1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)MMP-2 siRNA及P4Hα1siRNA能升高或降低病理性牽張力(18% elongation,1Hz)引起的膠原蛋白的表達(dá),證明在病理性牽張力作用下,MMP-2及P4Hα1參與對(duì)膠原的調(diào)節(jié)。4.4.體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證壓力負(fù)荷對(duì)血管平滑肌細(xì)胞P4Hα1、MMPs、TIMPs及膠原表達(dá)的影響應(yīng)用明膠酶譜法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),大鼠腹主動(dòng)脈縮窄7天后MMP-2的活性顯著增加(p0.05),但未能檢測(cè)出MMP-9的活性。免疫組化及Western blot結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比,大鼠腹主動(dòng)脈縮窄后,P4Ha1及MMP-2表達(dá)升高(p0.05),而TIMP-1及TIMP-2的表達(dá)沒有明顯變化(p0.05)。應(yīng)用Mssson染色及Western blot檢測(cè)壓力負(fù)荷增加對(duì)膠原蛋白的影響,結(jié)果提示大鼠腹主動(dòng)脈縮窄后血管內(nèi)膠原含量增加(p0.05)。4.5.Akt在病理性牽張力調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞MMP-2及P4Ha1表達(dá)中的作用病理性牽張力(18% elongation,1Hz)使得磷酸化Akt水平升高(p0.05)。給予平滑肌細(xì)胞Akt抑制劑LY294002預(yù)處理1小時(shí),然后給予18%牽張力刺激12小時(shí),發(fā)現(xiàn)LY294002預(yù)處理可降低病理性牽張力誘導(dǎo)的MMP-2表達(dá)上調(diào)及活性升高(P0.05),卻并不降低牽張力誘導(dǎo)的P4Hα1表達(dá)上調(diào)(P0.05)。表明Akt參與病理性牽張力對(duì)MMP-2表達(dá)的調(diào)節(jié),不參與對(duì)病理性牽張力對(duì)P4Hα1表達(dá)的調(diào)節(jié)。4.6. MAPKs在病理性牽張力調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞MMP-2及P4Ha1表達(dá)中的作用病理性牽張力(18% elongation,1Hz)使得磷酸化p38及磷酸化JNK水平升高(p0.05),而對(duì)磷酸化ERK的表達(dá)沒有影響(P0.05)。我們應(yīng)用MAPKs的抑制劑SB203580、SP600125和PD98059干預(yù)病理性牽張力(18% elongation,1Hz)刺激。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SB203580、SP600125和PD98059對(duì)病理性牽張力促進(jìn)MMP-2表達(dá)的作用沒有明顯影響(P0.05),對(duì)升高M(jìn)MP-2活性的作用亦沒有明顯影響(P0.05)。然而,SB203580和SP600125能夠阻斷病理性牽張力對(duì)P4Hα1的上調(diào)作用(P0.01)。表明MAPKs不參與病理性牽張力對(duì)MMP-2表達(dá)的調(diào)節(jié),p38和JNK參與病理性牽張力對(duì)P4Hα1表達(dá)的調(diào)節(jié)。4.7ACE2對(duì)MMP-2及P4Ha1表達(dá)的影響我們前期研究發(fā)現(xiàn),ACE2不參與病理性牽張力(18% elongation,1Hz)對(duì)膠原代謝的調(diào)節(jié)。而MMP-2和P4Hα1參與病理性牽張力對(duì)膠原代謝的影響。本研究探討了ACE2對(duì)MMP-2及P4Hα1表達(dá)的影響。應(yīng)用siRNA干擾ACE2的表達(dá),發(fā)現(xiàn)ACE2 siRNA對(duì)平滑肌細(xì)胞內(nèi)MMP-2和P4Hαl的表達(dá)沒有明顯影響(P0.05),進(jìn)一步表明了ACE2不參與病理性牽張力對(duì)膠原代謝調(diào)節(jié)的作用。5.結(jié)論(1)病理性牽張力(18% elongation,1Hz)上調(diào)P4Hα1、MMP-2及膠原的表達(dá),對(duì)TMP-1和TIMP-2的表達(dá)沒有影響；(2)18%牽張力通過激活A(yù)kt和p38 MAPK-JNK信號(hào)通路促進(jìn)MMP-2、 P4Hα1的表達(dá)。(3)MMP-2及P4Hα1參與病理性牽張力對(duì)膠原代謝的影響,ACE2不參與病理性牽張力對(duì)膠原代謝的影響,且ACE2對(duì)不影響平滑肌細(xì)胞內(nèi)MMP-2和P4Hal的表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R54
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本文編號(hào)：1559734