本文關(guān)鍵詞： 細(xì)胞衰老 信號(hào)通路 平滑肌標(biāo)志物 成骨樣轉(zhuǎn)化 高血壓　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)衰老是動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓等心血管疾病發(fā)生發(fā)展的誘因之一。衰老的VSMC通過(guò)分泌致炎因子和血管重構(gòu)相關(guān)因子促進(jìn)血管重構(gòu)和血管老化,其中,成骨樣轉(zhuǎn)化是伴隨細(xì)胞衰老而出現(xiàn)的一種表型重構(gòu)形式,后者是誘發(fā)血管硬化、組織器官退行性變和功能失調(diào)的重要因素。衰老的細(xì)胞具有生長(zhǎng)停滯、細(xì)胞骨架僵硬、炎性因子分泌增多等特征性表現(xiàn)。平滑肌(smooth muscle,SM)22α蛋白是一種平滑肌特異性標(biāo)志物,主要分布于成熟平滑肌細(xì)胞,其基本功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架形成。近年研究顯示,在衰老細(xì)胞中SM22α表達(dá)升高,SM22α的同源蛋白Scp1p敲除后可延長(zhǎng)酵母細(xì)胞壽命。然而,SM22α與細(xì)胞衰老的因果關(guān)系和分子機(jī)制尚不清楚。目的:本研究以血管緊張素II(angiotensin II,Ang II)為誘導(dǎo)因素,通過(guò)建立VSMC衰老模型,試圖從體內(nèi)外證實(shí)SM22α在VSMC衰老和血管老化進(jìn)程中的作用,并探討其作用機(jī)制,以期為揭示衰老相關(guān)心血管疾病的發(fā)生機(jī)制提供研究證據(jù)。方法:利用Ang II(10-7 mol/L)慢性刺激VSMC(5天),獲得VSMC應(yīng)激衰老模型;利用連續(xù)傳代的方法建立VSMC復(fù)制衰老模型。用野生型和Sm22α基因敲除小鼠皮下植泵,持續(xù)灌注Ang II(1μg/kg/min)四周,復(fù)制高血壓模型。通過(guò)敲低和過(guò)表達(dá)SM22α以觀察其對(duì)VSMC衰老及相關(guān)調(diào)控通路蛋白表達(dá)和活性的影響。衰老相關(guān)標(biāo)志物SA-β-gal染色分析、Real-time PCR、Western blot、免疫熒光和免疫組化檢測(cè)用于鑒定VSMC衰老;免疫共沉淀檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用。使用鈣化培養(yǎng)基(含有2.5 mmol/L磷酸鹽的低糖DMEM培養(yǎng)基)處理細(xì)胞,誘導(dǎo)VSMC鈣化;用茜素紅染色、鈣離子含量測(cè)定以及鈣化標(biāo)志物檢測(cè)進(jìn)行表型鑒定。結(jié)果:1 SM22α促進(jìn)Ang II誘導(dǎo)的VSMC衰老1.1 Ang II誘導(dǎo)VSMC衰老過(guò)程中SM22α表達(dá)上調(diào)為了確定SM22α在VSMC衰老過(guò)程中的作用,利用Ang II誘導(dǎo)建立VSMC衰老模型。Ang II持續(xù)刺激VSMC 5天和7天后,SA-β-gal活性顯著增強(qiáng),衰老標(biāo)志蛋白p53、p21和γ-H2AX表達(dá)增高,核增殖抗原PCNA表達(dá)下調(diào),表明細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)停滯的衰老狀態(tài);Western blot結(jié)果顯示,在此過(guò)程中,SM22α的表達(dá)顯著上調(diào),與細(xì)胞衰老進(jìn)程具有平行關(guān)系。1.2 SM22α促進(jìn)Ang II誘導(dǎo)的VSMC衰老為確定SM22α在VSMC衰老過(guò)程中表達(dá)增高的意義,分別利用小干擾RNA敲低和腺病毒載體過(guò)表達(dá)SM22α,觀察其對(duì)VSMC衰老的影響。結(jié)果顯示,敲低SM22α表達(dá)可降低衰老標(biāo)志物的表達(dá)水平和活性,SA-β-gal活性增高以及p53和p21表達(dá)明顯低于對(duì)照組;而過(guò)表達(dá)SM22α則可促進(jìn)Ang II誘導(dǎo)的SA-β-gal活性增高以及p53和p21表達(dá)增加。結(jié)果表明,SM22α對(duì)Ang II誘導(dǎo)的VSMC衰老具有促進(jìn)作用。1.3缺失SM22α可改善Ang II誘導(dǎo)的高血壓和血管老化為驗(yàn)證SM22α是否在體內(nèi)也具有促進(jìn)VSMC衰老的作用,通過(guò)皮下植入Ang II微滲透泵復(fù)制高血壓模型,觀察模型小鼠血壓變化以及與血管老化的關(guān)系。結(jié)果顯示,Sm22α-/-小鼠血壓升高幅度較野生型小鼠明顯降低,并且其主動(dòng)脈組織中p53和p21蛋白表達(dá)水平和SA-β-gal活性也低于野生型小鼠。進(jìn)一步提示SM22α表達(dá)增加與VSMC衰老具有因果關(guān)系。2 SM22α促進(jìn)VSMC衰老的機(jī)制2.1 SM22α抑制p53泛素化前已證實(shí),VSMC衰老過(guò)程中,SM22α與p53表達(dá)變化具有相同趨勢(shì)。為確定二者之間是否具有內(nèi)在因果關(guān)系,通過(guò)敲低和過(guò)表達(dá)SM22α,觀察對(duì)p53表達(dá)的影響。結(jié)果表明,在Ang II誘導(dǎo)VSMC衰老過(guò)程中,無(wú)論是敲低還是過(guò)表達(dá)SM22α,對(duì)p53的m RNA水平都沒(méi)有明顯影響;但是,敲低SM22α可提高p53泛素化水平,而過(guò)表達(dá)SM22α則降低p53泛素化。提示SM22α可影響p53的泛素化修飾。2.2 SM22α抑制Mdm-2與p53的相互作用泛素化蛋白酶體途徑是p53降解的主要機(jī)制。為進(jìn)一步揭示SM22α調(diào)節(jié)p53泛素化的分子機(jī)制,利用免疫共沉淀的方法檢測(cè)p53與其泛素連接酶Mdm-2結(jié)合是否受SM22α表達(dá)的影響。結(jié)果表明,在Ang II誘導(dǎo)VSMC衰老條件下,SM22α表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)Mdm-2與p53的結(jié)合,上調(diào)SM22α表達(dá)則抑制Mdm-2與p53的結(jié)合;用Mdm-2抑制劑nutlin-3預(yù)孵育VSMC可逆轉(zhuǎn)SM22α表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致的Mdm-2與p53相互作用,伴隨p53泛素化水平降低和表達(dá)升高。上述結(jié)果表明,SM22α通過(guò)抑制Mdm-2與p53的相互作用進(jìn)而抑制p53的泛素化降解。2.3 SM22α抑制Akt-Mdm-2通路活化為探究SM22α影響p53泛素化降解的上游信號(hào)通路,檢測(cè)SM22α表達(dá)改變對(duì)Akt-Mdm-2信號(hào)通路活化的影響。結(jié)果顯示,在Ang II誘導(dǎo)VSMC衰老條件下,敲低SM22α表達(dá)可促進(jìn)Akt-Mdm-2激活,相反,過(guò)表達(dá)SM22α則抑制Akt-Mdm-2通路的激活;用PI3K/Akt抑制劑LY294002預(yù)孵育VSMC可消除敲低SM22α引發(fā)的Akt-Mdm-2激活效應(yīng)。同樣,在Sm22α基因敲除小鼠動(dòng)脈組織中Akt和Mdm-2的磷酸化水平也顯著高于野生型小鼠。結(jié)果表明,SM22α對(duì)p53泛素化降解的調(diào)節(jié)是通過(guò)Akt-Mdm-2信號(hào)通路介導(dǎo)的,過(guò)量的SM22α具有穩(wěn)定p53的作用。3 VSMC衰老誘發(fā)血管鈣化的初步研究3.1 VSMC復(fù)制性衰老促進(jìn)細(xì)胞鈣化為確定VSMC衰老與血管鈣化的關(guān)系,首先利用連續(xù)傳代的方法建立細(xì)胞復(fù)制性衰老模型,再換用高磷酸鹽鈣化培養(yǎng)基誘導(dǎo)鈣化。SA-β-gal衰老染色和衰老標(biāo)志物檢測(cè)表明,13代(P13)的VSMC表現(xiàn)出明顯的衰老特征。茜素紅染色和鈣離子含量測(cè)定結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,P13的VSMC鈣離子沉積明顯;鈣化相關(guān)調(diào)控因子BMP-2,OPN和ALP的表達(dá)活性升高,表明衰老的VSMC發(fā)生成骨樣轉(zhuǎn)化。3.2 VSMC應(yīng)激性衰老與細(xì)胞鈣化的關(guān)系為確定VSMC應(yīng)激誘導(dǎo)衰老與鈣化的關(guān)系,利用Ang II誘導(dǎo)VSMC應(yīng)激衰老,并誘導(dǎo)鈣化。細(xì)胞鈣化檢測(cè)結(jié)果顯示,發(fā)生應(yīng)激性衰老的VSMC其鈣離子沉積明顯增多,鈣化相關(guān)調(diào)控因子BMP-2,OPN和ALP的活性也明顯高于未衰老的細(xì)胞。結(jié)果表明,應(yīng)激性衰老同樣可促進(jìn)細(xì)胞鈣化發(fā)生。3.3敲低SM22α表達(dá)可抑制衰老相關(guān)鈣化基于前兩部分的研究發(fā)現(xiàn),敲低SM22α可抑制細(xì)胞衰老,進(jìn)而分析其與細(xì)胞鈣化的關(guān)系。結(jié)果顯示,si SM22α和Sm22α-/-組VSMC鈣離子沉積減少,鈣化調(diào)控因子BMP-2表達(dá)下調(diào)和ALP的活性下降,與減弱的衰老表型相一致,間接證明VSMC衰老與細(xì)胞鈣化的因果關(guān)系。結(jié)論:1細(xì)胞衰老過(guò)程中SM22α表達(dá)增加。2過(guò)量的SM22α促進(jìn)VSMC衰老和血管老化。3 SM22α蓄積抑制衰老相關(guān)信號(hào)通路Akt-Mdm-2的活化,減少p53泛素化降解,提高p53穩(wěn)定性。4細(xì)胞衰老可促進(jìn)VSMC成骨樣轉(zhuǎn)化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R54

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