本文關(guān)鍵詞： 內(nèi)皮細(xì)胞 內(nèi)皮功能障礙 T-cadherin 2型糖尿病 NO生物活性 血管環(huán)　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景21世紀(jì)以來,糖尿病發(fā)病率在世界范圍內(nèi)急速升高,目前已成為人類健康的重大威脅。糖尿病患者中,約90%以上為以胰島素抵抗為特征的2型糖尿病。而與2型糖尿病伴隨發(fā)展的并發(fā)癥,特別是心血管并發(fā)癥,已成為糖尿病致死的重要組成原因。血管內(nèi)皮功能障礙是以NO生物活性減少為主要特征的病理改變,在體條件下往往表現(xiàn)為內(nèi)皮依賴性的血管舒張功能降低。內(nèi)皮功能障礙作為動脈粥樣硬化的始動因素在2型糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而目前改善內(nèi)皮損傷的有效治療措施十分有限,相應(yīng)的臨床應(yīng)用也未取得令人滿意的進展。因此,闡明血管內(nèi)皮功能障礙參與2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的潛在分子機制并找尋相應(yīng)的治療靶點對于糖尿病心血管并發(fā)癥患者意義重大。T-cadherin(T-cad)是鈣粘蛋白(cadherin)家族成員中的一員,但與其他家族成員不同的是,T-cad位于細(xì)胞表面的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域缺失。T-cad全身表達含量最高的部位是血管組織。大量研究表明,T-cad在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能方面發(fā)揮重要作用。值得注意的是,近期有研究指出在2型糖尿病發(fā)展早期,T-cad表達水平在粥樣硬化斑塊局部出現(xiàn)明顯升高。此外,亦有針對2型糖尿病的臨床研究證實,T-cad表達水平與2型糖尿病發(fā)病率之間存在相關(guān)性。然而迄今為止,學(xué)術(shù)界對于T-cad在糖尿病血管并發(fā)癥中所發(fā)揮的作用仍知之甚少。相關(guān)研究報道也十分有限,而針對大體動物的功能性研究更是幾乎為零。因此,本研究在我們實驗室的既往研究基礎(chǔ)上,成功構(gòu)建小鼠2型糖尿病模型,并擬通過在體及離體實驗研究探討T-cad在糖尿病血管內(nèi)皮損傷中發(fā)揮的作用及其機制。研究目的1.明確T-cad表達對野生小鼠及2型糖尿病小鼠血管損傷與內(nèi)皮功能障礙的作用2.探索研究T-cad表達下調(diào)介導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生機制研究方法1.為構(gòu)建小鼠2型糖尿病模型,我們采用進口的高脂飼料,將8周齡雄性C57BL/6j小鼠隨機分為兩組,一組為正常飲食對照(normal diet,ND)組,另一組為高脂飲食(high-fat diet,HFD)喂養(yǎng)組。ND組使用普通飼料(10%kcal脂肪)飼喂,HFD組使用高脂飼料(60%kcal)飼喂,飲水不做限制,持續(xù)喂養(yǎng)8周。每周監(jiān)測體重及空腹血糖水平,8周時檢測空腹血清胰島素,空腹血清甘油三酯,總膽固醇及HOMA-IR指數(shù),作為小鼠2型糖尿病造模成功指標(biāo)。2.為檢測糖尿病小鼠是否存在T-cad表達含量異常,我們分離造模成功的ND組野生小鼠與HFD組野生小鼠的血管組織,用Western Blot(WB)法及實時定量PCR(q RT-PCR)法檢測血管組織T-cadherin表達水平。3.為直接觀察T-cad表達變化對小鼠血管舒張功能的影響,我們分離T-cad KO小鼠與野生小鼠的降主動脈,之后再加工成血管環(huán)。我們將得到的兩組血管環(huán)隨機分為兩組:乙酰膽堿(內(nèi)皮依賴性血管舒張劑)處理組與酸化亞硝酸鈉(內(nèi)皮非依賴型血管舒張劑)處理組,使用DMT多通道成像系統(tǒng)檢測分析血管環(huán)舒張功能。4.為直接觀察高糖高脂環(huán)境下,T-cad表達變化對小鼠血管舒張功能的進一步影響,我們分離T-cad KO小鼠與野生小鼠的降主動脈,之后再加工成血管環(huán)。我們使用配制好的高糖高脂工作液干預(yù)血管環(huán)(HG,終濃度25.5 mmol/l;HF,終濃度300μmol/l),將血管環(huán)隨機分為兩組:T-cad KO+HGHF與WT+HGHF組,使用DMT多通道成像系統(tǒng)檢測分析血管環(huán)舒張功能。5.為進一步證實T-cad表達變化對2型糖尿病小鼠血管舒張功能的影響,我們使用高脂飼料飼喂T-cad KO小鼠與野生小鼠8周,之后分離兩組小鼠的降主動脈,加工成血管環(huán),分為T-cad KO+HFD 8w與WT+HFD 8w組,使用DMT多通道成像系統(tǒng)檢測分析血管環(huán)舒張功能。6.為進一步研究T-cad表達下調(diào)對小鼠血管舒張功能影響的潛在機制,我們分離T-cad KO小鼠與野生小鼠的血管組織,然后使用還原劑將血管組織中的硝酸鹽還原成NO,再使用可以精確檢測NO氣體的分析系統(tǒng)(SIEVERS 280)檢測血管組織NO的累積生成總量。7.為證實T-cad表達下調(diào)通過降低NO生成影響血管舒張功能,我們收集剛做完血管環(huán)實驗的實驗池液體,加入還原劑后直接使用可以精確檢測NO氣體的分析系統(tǒng)(SIEVERS 280)檢測其中的NO含量。8.為確定血管組織NO生成減少的分子機制,我們分離提取了T-cad KO小鼠與野生小鼠的血管組織蛋白,然后使用Western Blot技術(shù)檢測兩組小鼠血管組織中的p-Akt/Akt,與p-e NOS/e NOS蛋白水平。9.為驗證Akt抑制劑的有效性,我們培養(yǎng)了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),然后將細(xì)胞隨機分為正常對照組和Akt抑制劑處理組(Akt抑制劑處理細(xì)胞24小時),并使用Western Blot技術(shù)檢測細(xì)胞的p-Akt與Akt表達水平。10.為進一步明確T-cad表達下調(diào)導(dǎo)致NO生成降低的潛在原因,在之前實驗的基礎(chǔ)上,我們培養(yǎng)了HUVECs,并將細(xì)胞隨機分為正常對照組與Akt抑制劑處理組,再使用Caspase-3活性檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞的凋亡水平。11.為進一步明確T-cad表達下調(diào)通過降低NO生物活性導(dǎo)致小鼠血管舒張功能下降的潛在機制,我們分離提取了T-cad KO小鼠與野生小鼠的血管組織蛋白,然后使用ELISA法檢測兩組血管蛋白的硝基酪氨酸含量。12.為獲得支持T-cad表達下調(diào)通過增加NO失活導(dǎo)致小鼠血管舒張功能下降的進一步證據(jù),我們分離了T-cad KO小鼠與野生小鼠的血管組織,并使用超氧化物分析儀檢測兩組血管組織超氧化物生成總量。研究結(jié)果1.高脂飲食飼喂8周齡雄性C57BL/6j小鼠8周后,相較于正常飲食喂養(yǎng)組,高脂飲食喂養(yǎng)組小鼠的平均體重顯著增加(P0.01),平均空腹血糖顯著升高(P0.01),平均空腹血清胰島素水平顯著升高(P0.01),平均血清甘油三酯水平(P0.05)與總膽固醇水平顯著升高(P0.01),HOMA-IR指數(shù)也顯著提高(P0.01),表明高脂飲食飼喂8周成功制備小鼠2型糖尿病模型。2.高脂飲食飼喂8周后,相比ND組,HFD組小鼠血管組織中T-cad的蛋白水平明顯降低(P0.01),同時m RNA水平與蛋白表達變化趨勢一致,但并無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。3.在正常對照小鼠組中,乙酰膽堿與酸化亞硝酸鈉誘導(dǎo)的血管環(huán)舒張程度相當(dāng),無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。而在T-cad KO小鼠的血管環(huán)中,相較于酸化亞硝酸鈉處理而言,乙酰膽堿處理導(dǎo)致的濃度依賴性血管舒張則明顯降低(P0.05)。4.體外高糖高脂干預(yù)處理WT和T-cad KO兩組小鼠主動脈環(huán)2.5小時后,發(fā)現(xiàn)兩組主動脈環(huán)舒張功能均受到不同程度的損傷。然而與WT組相比,T-cad KO組血管的濃度依賴性舒張受損更為嚴(yán)重,具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。5.使用高脂飲食持續(xù)飼喂WT小鼠和T-cad KO小鼠共8周。發(fā)現(xiàn)WT和T-cad KO兩組小鼠的血管環(huán)舒張程度均出現(xiàn)不同程度的減少。然而相比正常飲食喂養(yǎng)組,HFD喂養(yǎng)組小鼠血管的濃度依賴性舒張受損更為嚴(yán)重,具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。6.使用還原劑將血管組織中的硝酸鹽還原為NO后,相較WT組,T-cad KO組小鼠血管組織的NO積累總量與NOx的生成量均出現(xiàn)明顯降低,兩項指標(biāo)的差異均具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),提示T-cad表達下調(diào)導(dǎo)致NO生成減少。7.相較WT組而言,T-cad KO組小鼠血管組織的p-Akt蛋白水平明顯下降,Akt蛋白水平無明顯變化,p-e NOS及e NOS蛋白水平均輕微增高,但并無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。綜合而言,與WT組對比,T-cad KO組血管組織的p-Akt與Akt的比值明顯降低,具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),但p-e NOS與e NOS的比值并無明顯變化,兩組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。8.與對照組相比,經(jīng)Akt抑制劑處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的Akt磷酸化水平明顯降低(P0.01)并伴隨細(xì)胞Caspase-3活性明顯升高(P0.05),提示Akt活性被抑制后,內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平明顯增加。9.與WT組對比,T-cad KO組小鼠血管組織的超氧化物含量與硝基酪氨酸水平均顯著增加,兩項指標(biāo)的差異均具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),提示T-cad表達下調(diào)導(dǎo)致NO失活加劇。結(jié)論1.使用高脂飲食飼喂小鼠8周成功制作小鼠2型糖尿病模型,同時觀察到2型糖尿病條件下,小鼠血管組織T-cad出現(xiàn)表達下調(diào)。2.采用DMT多通道分析系統(tǒng)首次獲得野生小鼠與2型糖尿病小鼠T-cad表達下調(diào)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙的離體功能學(xué)證據(jù)。3.機制研究表明,以NO合成減少和NO失活加劇為特征的NO生物活性降低是T-cad表達下調(diào)導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙的原因。綜上所述,我們的研究不僅首次獲得了生理條件或2型糖尿病條件下,小鼠T-cad表達下調(diào)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙的離體功能學(xué)證據(jù),同時部分闡明了其潛在的病理機制,而如何干預(yù)或治療T-cad表達不足則很有可能成為臨床上防治糖尿病血管損傷的潛在治療靶點。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2;R54
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本文編號：1528655