本文關(guān)鍵詞： SALL4 MDS 預后判斷 DNA損傷修復 轉(zhuǎn)基因 條件性基因敲除　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景骨髓增生異常綜合征(Myelodysplastic syndromes, MDS)是一種造血干細胞克隆性疾病,其主要特點為骨髓無效造血導致外周血細胞減少,以及造血干細胞基因組不穩(wěn)定導致向急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia, AML)高轉(zhuǎn)化的危險。由于MDS分型復雜,不同類型的MDS具有不同的病態(tài)造血表現(xiàn),這給MDS的診斷、治療和預后監(jiān)測帶來了很大困惑。SALL4是果蠅婆羅雙樹基因(Drosophila spalt)的同源基因,定位于第20號染色體的q13.13-q13.2。近來研究表明,SALL4在維持胚胎干細胞的多能性方面起著重要作用,并與造血發(fā)育和血液惡性腫瘤的發(fā)生具有相關(guān)性。SALL4B過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生了MDS類似征候群,進而轉(zhuǎn)化為白血病。然而SALL4在MDS各亞型中的具體表達模式及臨床應用價值目前國內(nèi)外尚沒有報道。本研究中我們一方面從基因和蛋白兩個水平分析SALL4在MDS不同亞型和分期中的表達模式,同時對MDS患者進行長期隨訪評價SALL4在MDS預后判斷中的臨床價值；另一方面采用SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠模型和SALL4條件性基因敲除模型從基因功能獲得和缺失兩個角度深入探討SALL4在MDS及AML發(fā)生發(fā)展中的作用機制。材料和方法本研究主要分為三個部分,第一部分中我們對2009年12月至2011年12月間就診于北京協(xié)和醫(yī)院、北京西苑醫(yī)院、北京醫(yī)院及北京市道培醫(yī)院的部分MDS患者,其中新發(fā)MDS 55例,已進展為AML的MDS 20例,經(jīng)治療后好轉(zhuǎn)的MDS 16例以及10例健康骨髓供者的骨髓及外周血標本提取RNA和蛋白質(zhì),分別采用實時熒光定量PCR技術(shù)及Western blot技術(shù)分析SALL4在MDS患者不同WHO分型及國際預后評分系統(tǒng)(International Prognostic Scoring System,IPSS)預后分期中的表達水平,同時對55例新發(fā)MDS患者進行長達兩年的隨訪,評估SALL4在MDS預后判斷中的臨床價值。第二部分中我們采用SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠模型,通過同源重組(Homologous recombination, HR)和非同源重組性末端連接(Non-homologous end j oining, NHEJ)報告質(zhì)粒研究SALL4在DNA損傷修復及染色體穩(wěn)定性方面的作用,進一步探討SALL4在MDS發(fā)生發(fā)展中的作用機制。第三部分中我們采用SALL4條件性基因敲除小鼠模型,通過骨髓移植及集落培養(yǎng)傳代技術(shù),從體內(nèi)試驗和體外試驗兩個方面研究SALL4在Hoxa9/Meis1白血病系統(tǒng)中的作用。結(jié)果第一部分研究發(fā)現(xiàn),SALL4高表達于部分治療前MDS患者骨髓及外周血細胞中,并且在MDS向AML轉(zhuǎn)化的患者中表達增高,在治療后MDS患者中表達降低。而在不同類型的MDS患者中,SALL4高表達主要見于難治性貧血伴原始細胞增多1型(Refractory anemia with excess blasts-1, RAEB-1)和2型(RAEB-2)及IPSS中危二期及高危期,這種表達模式與Bmi-1的表達模式相類似。我們還發(fā)現(xiàn)SALL4表達水平與MDS部分臨床參數(shù)如骨髓原始細胞百分比、染色體核型、IPSS分值等之間具有良好相關(guān)性。我們對本研究中的MDS患者進行了長達兩年的隨訪,結(jié)果表明SALL4表達水平較高的患者臨床預后較差,提示SALL4在MDS患者的預后判斷中具有潛在的應用價值。第二部分對SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究發(fā)現(xiàn),SALL4在MDS中具有抑制DNA損傷修復和抑制凋亡的雙重作用,在SALL4高表達的MDS骨髓細胞中,當DNA受到損傷時,一方面由于SALL4升高引起FANCL介導的HR DNA修復程序受損而使損傷不能得到完全修復,另一方面由于SALL4升高引起B(yǎng)CL2介導的抑制凋亡使受損細胞不能凋亡,從而使帶有DNA損傷的細胞得以存活下來,隨著其他損傷及突變的累積最終導致白血病的發(fā)生。第三部分對SALL4條件性基因敲除小鼠模型研究發(fā)現(xiàn),該SALL4條件性基因敲除小鼠在正常造血發(fā)育過程中與野生型小鼠相比,在Hoxa9/Meis1白血病模型中,SALL4條件性基因敲除小鼠骨髓細胞雖然能在Hoxa9/Meisl作用下進行轉(zhuǎn)化,并在第一次移植后的受體小鼠內(nèi)誘發(fā)白血病,但在第二次移植后,其致白血病能力明顯喪失,提示SALL4在維持白血病發(fā)展方面具有作用,這為SALL4升高的MDS及白血病的靶向治療提供了新的契機。結(jié)論我們首次報道了干細胞因子SALL4在MDS不同WHO亞型及IPSS分期中的表達水平,提出SALL4在MDS的預后判斷中具有潛在的臨床應用價值。我們首次報道了干細胞因子SALL4在MDS中具有抑制DNA損傷修復和抑制受損細胞凋亡的雙重作用,并通過HR和NHEJ報告質(zhì)粒證實SALL4過表達主要抑制HR修復通路。本研究首次采用SALL4條件性基因敲除小鼠從從基因功能缺失方面研究SALL4在白血病發(fā)生發(fā)展中的必要性,SALL4條件性基因敲除小鼠骨髓細胞雖能經(jīng)HOXA9/Meis1轉(zhuǎn)化并在第一次移植后誘導白血病,但最終由于缺乏SALL4在二次移植后致白血病能力喪失,這為SALL4升高的MDS及白血病的靶向治療提供了新的契機。
[Abstract]:鑳屾櫙楠ㄩ珦澧炵敓寮傚父緇煎悎寰，

本文編號：1525823