本文關鍵詞： 心肌缺血再灌注損傷 IL-21 IL-21R MIRI IL-21 中性粒細胞 趨化因子 IL-21 信號通路 JAK-STAT PI3K/Akt MAPK NF-κB　出處：《華中科技大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分 IL-21在小鼠心肌缺血再灌注損傷中的表達規(guī)律及作用目的：免疫系統(tǒng)激活在心肌缺血再灌注損傷(MIRI)中發(fā)揮的重要作用已得到廣泛證實。IL-21是一種多效性細胞因子,其在MIRI中的作用尚不明確。本部分實驗旨在研究IL-21及其受體在小鼠MIRI中的表達規(guī)律,并探討IL-21對MIRI的作用。方法：通過結扎冠狀動脈左前降支構建小鼠MIRI模型,通過real-time PCR和western blot檢測缺血再灌注后不同時間點(30 min、1 h、6 h、12 h、24 h)心肌組織IL-21及受體特異鏈IL-21R的表達水平。為明確IL-21在MIRI中的作用,在再灌注前給予IL-21中和性抗體或重組小鼠IL-21對MIRI模型進行預處理以阻斷或增強IL-21的效應,于再灌注1天時檢測MIRI相關各項指標的改變,包括Even's blue/TTC雙染色法測定心肌梗死面積、血清肌鈣蛋白(TnT)檢測心肌損傷以及心臟超聲測定左室射血分數(shù)(EF)和左室縮短分數(shù)(FS)評價心功能。結果：與假手術組相比,再灌注后30 min小鼠心肌組織中IL-21 mRNA和蛋白表達均開始升高,并持續(xù)至再灌注后24 h。IL-21受體特異鏈IL-21R mRNA和蛋白表達均在再灌注后12h開始升高,并持續(xù)至24 h。與同型對照抗體組相比,中和IL-21的作用能夠縮小梗死面積、降低血清TnT水平及改善心功能。與之相反,外源性給予重組IL-21則明顯增加心肌梗死面積、升高血清cTnT水平,并使心功能損傷加重。結論：IL-21及其受體在小鼠MIRI后早期表達上調;中和內源性IL-21可減輕MIRI,而外源性IL-21干預則會加重MIRI。第二部分I L一21通過募集中性粒細胞浸潤參與心肌缺血再灌注損傷目的：以往研究表明,MIRI后大量中性粒細胞浸潤及其介導的炎癥反應是加重MIRI的重要機制之一。本部分實驗旨在探討IL-21是否影響MIRI后中性粒細胞浸潤,及其相關機制。方法：8-12周齡雄性C57B/L6小鼠隨機分為假手術組、MIRI對照組、MIRI外源性IL-21干預組,應用流式細胞術定量檢測再灌注3h后局部心肌組織中性粒浸潤的數(shù)目：Real-time PCR檢測心肌組織ELR+CXC趨化因子KC、MIP-2和LIX的表達。體外分離培養(yǎng)C57B/L6小鼠乳鼠心肌細胞和心臟成纖維細胞,給予IL-21刺激后通過real-time PCR檢測KC和MIP-2 mRNA表達,ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中KC和MIP-2的濃度。體外分離成年C57B/L6小鼠骨髓中性粒細胞,與有或無IL-21刺激的心肌細胞或心臟成纖維細胞培養(yǎng)上清分別置于transwell上、下小室中,檢測中性粒細胞遷移活性。結果：流式細胞術定量分析顯示,與假手術組相比,MIRI組小鼠心肌組織中性粒細胞浸潤數(shù)目增加,而給予外源性IL-21干預進一步增加了心肌組織中性粒細胞浸潤程度。給予外源性IL-21上調了再灌注后30 min和3h心肌組織KC、MIP-2 mRNA表達,而不影響LIX表達。體外實驗中,給予IL-21刺激1h后,心肌細胞、心臟成纖維細胞KC和MIP-2 mRNA表達均較對照組明顯升高；給予IL-21刺激24 h后,兩種細胞培養(yǎng)上清中KC、MIP-2濃度亦明顯升高。中性粒細胞趨化實驗結果顯示,IL-21刺激心肌細胞、心臟成纖維細胞后的條件培養(yǎng)上清能夠促進中性粒細胞遷移。結論：IL-21可能通過上調心肌細胞和心臟成纖維細胞中趨化因子KC和MIP-2的表達,促進中性粒細胞遷移,進而介導MIRI后心肌組織局部中性粒細胞浸潤。第三部分 IL-21促進心肌缺血再灌注損傷和中性粒細胞浸潤的分子機制目的：以往研究表明,JAK-STAT(主要是STAT1和STAT3)、PI3K/Akt、ERK、p38 MAPK和NF--kB等信號通路參與了IL-21在不同細胞類型的不同生物學效應；同時,上述信號通路也在MIRI的調控中發(fā)揮重要作用。本部分實驗通過在組織學和細胞學水平分別探討IL-21對上述信號通路激活的效應,以期闡明IL-21誘導心肌細胞、心臟成纖維細胞趨化因子表達,促進中性粒細胞浸潤并介導心肌損傷的分子機制。方法：8-12周齡雄性C57B/L6小鼠構建MIRI模型,取假手術組和MIRI再灌注不同時間點(10 min、30 min、60 min、120 min)心肌組織,western blot檢測ERK、p38 MAPK、 Akt、 NF-kB p65、 STAT1和STAT3通路激活的時間規(guī)律。構建小鼠MIRI模型,分為對照組和IL-21干預組,分別于再灌注后10min、30min通過western blot檢測IL-21對各信號通路關鍵分子磷酸化程度的改變。離體分離培養(yǎng)小鼠乳鼠心肌細胞、心臟成纖維細胞,western blot檢測IL-21刺激不同時間點(10 min、30 min、60 min、120 min)各信號通路磷酸化改變。為進一步明確IL-21處理后發(fā)生激活的信號通路是否為調控趨化因子表達的信號機制,于IL-21刺激兩種細胞前分別給予相應信號通路阻滯劑預處理,real-time PCR和ELISA分別檢測KC、MIP-2mRNA表達和分泌的改變。結果：在小鼠MIRI模型中,再灌注10 min時ERK、p38 MAPK和NF-κB p65即開始激活,而Akt、STAT1和STAT3在再灌注30 min后開始激活。進一步在再灌注10 min、30 min兩個時間點分別檢測在體IL-21干預對各信號通路激活的影響。結果顯示,再灌注10 min時,IL-21增強了p38 MAPK的激活效應；再灌注30 min時,IL-21可同時激活p38 MAPK和NF-κB信號通路。然而,IL-21對其他信號通路關鍵分子并無明顯激活效應。細胞水平上,心肌細胞在IL-21刺激10-30 min時表現(xiàn)為Akt激活,NF-κB p65是其下游信號分子,于30 min開始激活并持續(xù)至2 h。心臟成纖維細胞p38MAPK通路在IL-21刺激30 min后開始激活,而NF-κB p65于1h后開始激活。此外,IL-21處理心肌細胞、成纖維細胞后ERK、STAT1或STAT3通路均未見激活。在IL-21刺激前,心肌細胞給予PI3K/Akt阻滯劑或NF-κB阻滯劑預處理可顯著抑制KC、MIP-2mRNA表達,其分泌被部分抑制。相似地,心臟成纖維細胞給予p38 MAPK阻滯劑或NF-κB阻滯劑預處理同樣可顯著抑制KC、MIP-2mRNA表達和分泌。結論：心肌細胞Akt/NF-κB信號通路和心臟成纖維細胞p38 MAPK/NF-κB信號通路的激活是IL-21誘導趨化因子KC、MIP-2表達上調的重要信號通路機制。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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