本文關(guān)鍵詞： Takotsubo心肌病 硫化氫 心功能 NADPH氧化酶 ROS 氧化應(yīng)激 H9c2細(xì)胞 MAPK信號通路　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：Takotsubo心肌病(Takotsubo cardiomyopathy,TCM)發(fā)病急驟,臨床癥狀與急性冠脈綜合征相似,臨床中診斷為急性冠脈綜合征的患者中約有2%的患者為Takotsubo心肌病。Takotsubo心肌病急性死亡率大約1%-4.2%。由于此病急性發(fā)病時(shí)左心室收縮末期心尖部、心中部運(yùn)動不能,運(yùn)動不足或運(yùn)動障礙,心臟基底部收縮過度,病變時(shí)心臟形態(tài)類似于捕章魚的魚簍,所以命名為Takotsubo心肌病。Takotsubo心肌病多見于中老年女性患者,大部分患者發(fā)病前均有嚴(yán)重的精神或軀體應(yīng)激性誘因,臨床中患者以胸痛或心前區(qū)壓榨性疼痛為首發(fā)癥狀,也可表現(xiàn)為心悸、暈厥、惡心、嘔吐、呼吸困難,發(fā)病急性期可出現(xiàn)心源性休克、心臟驟停、室間隔缺損、急性肺水腫、呼吸衰竭、嚴(yán)重的室性心律失常以及心臟破裂等嚴(yán)重并發(fā)癥。但Takotsubo心肌病室壁運(yùn)動異常區(qū)域超過單支冠狀動脈支配范圍,且不伴有冠狀動脈閉塞。由于對Takotsubo心肌病的逐漸認(rèn)識和關(guān)注,臨床中發(fā)現(xiàn)的Takotsubo心肌病病例的數(shù)量持續(xù)增加,但對其發(fā)病機(jī)制、病理變化、規(guī)范治療仍然缺乏充分的依據(jù)。故進(jìn)一步研究該疾病有重要的臨床意義和社會價(jià)值。硫化氫(hydrogen sulfide,H_2S)是繼一氧化氮和一氧化碳之后,被發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號分子,其在哺乳動物體內(nèi)廣泛存在。硫化氫在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著非常關(guān)鍵的保護(hù)作用。各種心肌缺血模型和過度刺激β腎上腺素受體能夠使大鼠體內(nèi)H_2S含量明顯下降,給予外源性硫化氫或者促進(jìn)內(nèi)源性硫化氫產(chǎn)生,均可明顯減小缺血再灌注心肌的損傷面積和心梗死面積,從而對心肌發(fā)揮保護(hù)作用。H_2S可以通過開放心肌細(xì)胞KATP通道,減輕氧化應(yīng)激損傷、促進(jìn)體內(nèi)NO合成,抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性,抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、保護(hù)線粒體等多種機(jī)制發(fā)揮心血管的保護(hù)作用。目前,關(guān)于硫化氫對Takotsubo心肌病的保護(hù)作用機(jī)制仍不明確,本文利用Takotsubo心肌病動物模型和H9c2心肌細(xì)胞探討Takotsubo心肌病發(fā)病機(jī)制,探討硫化氫對Takotsubo心肌病的影響及其作用機(jī)制。本研究共分三部分。第一部分外源性硫化氫對takotsubo心肌病心功能的影響目的:探討外源性給予硫化氫是否可以調(diào)節(jié)和保護(hù)takotsubo心肌病動物模型的心功能方法:1本實(shí)驗(yàn)選用健康雄性spraguedawley(sd)大鼠,大鼠腹腔注射異丙腎上腺素(isoprenaline,iso)50mg/kg制備takotsubo心肌病大鼠模型.2應(yīng)用powerlab及換能器監(jiān)測takotsubo心肌病大鼠左心功能指標(biāo),并給予不同濃度的nahs(10,50,100,or200μmol/kg,i.p.)預(yù)處理,篩選出對takotsubo心肌病具有最佳保護(hù)作用的nahs濃度,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3心臟超聲觀察takotsubo心肌病大鼠的心功能及nahs對takotsubo心肌病的心功能影響。4檢測takotsubo心肌病大鼠的心肌酶及nahs對takotsubo心肌病的心肌酶影響。5he染色檢測心肌組織形態(tài)學(xué)變化6檢測takotsubo心肌病大鼠血漿及心肌組織硫化氫濃度及內(nèi)源性產(chǎn)生硫化氫的酶,觀察nahs對takotsubo心肌病大鼠血漿及心肌組織硫化氫濃度及內(nèi)源性產(chǎn)生硫化氫的酶的影響。結(jié)果:1takotsubo心肌病大鼠的左心室功能指標(biāo)lvsp及±dp/dtmax與對照組相比顯著下降,lvedp與對照組相比顯著升高。2takotsubo心肌病大鼠血漿及心肌組織中硫化氫水平明顯降低,心肌組織中cse、3-mst表達(dá)明顯降低,但對心肌組織cbs表達(dá)無明顯影響。nahs可以增加takotsubo心肌病大鼠血清及心肌組織中硫化氫水平,增加心肌組織中cse、3-mst蛋白表達(dá)。3不同劑量的nahs(10,50,100,200μmol/kg)能夠增加takotsubo心肌病大鼠lvsp及+dp/dtmax,降低lvedp。nahs100μmol/kg具有最明顯的保護(hù)效應(yīng)。4心臟超聲結(jié)果顯示,takotsubo心肌病大鼠lvef、lvfs明顯降低,心室壁運(yùn)動不規(guī)律,心尖部、心中部室壁收縮功能降低,心底部收縮正常,左心室病變時(shí)形狀類似于“章魚簍”或“氣球樣”改變。nahs預(yù)處理可以升高takotsubo心肌病大鼠lvef、lvfs,減輕takotsubo心肌病大鼠不規(guī)律室壁運(yùn)動。5takotsubo心肌病大鼠血漿中ck、ck-mb、ldh、ast水平均明顯升高。nahs可以降低takotsubo心肌病大鼠ck,ck-mb,ldh和ast活性。6takotsubo心肌病大鼠心肌he染色顯示心肌纖維完整,排列整齊,染色較均勻,結(jié)構(gòu)較清晰,細(xì)胞核、細(xì)胞裝完整,未見細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤。結(jié)論:1大鼠給予異丙腎上腺素可以很好的模擬臨床中takotsubo心肌病,左心功能指標(biāo)、心臟超聲檢查均提示心功能損傷,心肌酶ck、ck-mb、ldh、ast水平明顯升高。2nahs預(yù)處理可以改善takotsubo心肌病模型大鼠左心功能指標(biāo),提高lvef、lvfs,減輕室壁運(yùn)動的不規(guī)律。3takotsubo心肌病大鼠血清及心肌組織中硫化氫水平降低,心肌組織cse、3-mst蛋白表達(dá)降低。說明硫化氫在takotsubo心肌病發(fā)病過程及病理損害過程中發(fā)揮作用。nahs預(yù)處理可以增加takotsubo心肌病大鼠血清及心肌組織中硫化氫水平,使心肌組織cse、3-mst蛋白表達(dá)增加。第二部分外源性硫化氫通過抑制nadph氧化酶減輕takotsubo心肌病大鼠心肌氧化應(yīng)激損傷目的:觀察和探討硫化氫保護(hù)takotsubo心肌病心功能的機(jī)制方法:1心肌組織dhe染色觀察心肌組織超氧陰離子水平。2應(yīng)用h2o2、mda、sod、gsh試劑盒檢測血漿和心肌組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化。3westernblot檢測心肌組織中nox2、nox4、p67蛋白的表達(dá)。4tunel染色觀察心肌組織凋亡的變化。5westernblot檢測心肌組織中促凋亡蛋白bax和抑制凋亡蛋白bcl-xl蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1左心室冰凍切片dhe染色結(jié)果顯示:takotsubo心肌病大鼠心肌組織中超氧陰離子水平顯著增加,nahs預(yù)處理能夠降低takotsubo心肌病大鼠心肌組織中超氧陰離子。2takotsubo心肌病大鼠血漿及心肌組織中h2o2水平升高。nahs預(yù)處理可以降低takotsubo心肌病大鼠血漿及心肌組織中h2o2水平。3takotsubo心肌病大鼠血漿及心肌組織中mda水平升高。nahs預(yù)處理可以降低takotsubo心肌病大鼠血漿及心肌組織中mda水平。4takotsubo心肌病大鼠血漿及心肌組織中g(shù)sh水平降低。nahs預(yù)處理并未升高takotsubo心肌病大鼠血漿及心肌組織中g(shù)sh水平。5takotsubo心肌病大鼠血漿及心肌組織中sod活性沒有變化,nahs預(yù)處理也不改變sod活性。6takotsubo心肌病大鼠心肌組織中nox4和p67蛋白表達(dá)水平升高,nahs預(yù)處理可以降低takotsubo心肌病大鼠心肌組織中nox4和p67蛋白表達(dá)。7tunel染色結(jié)果顯示:takotsubo心肌病大鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量較明顯增加,nahs可以減少takotsubo心肌病大鼠心臟組織中凋亡細(xì)胞的數(shù)量。8takotsubo心肌病大鼠心肌組織抗凋亡蛋白bcl-xl的表達(dá)降低,促凋亡蛋白bax表達(dá)增加,bax/bcl-xl比值升高。nahs增強(qiáng)心肌組織抗凋亡蛋白bcl-xl的表達(dá),抑制促凋亡蛋白bax表達(dá),bax/bcl-xl比值降低。結(jié)論:1氧化應(yīng)激參與了takotsubo心肌病大鼠病理過程,nahs可以降低takotsubo心肌病大鼠血漿和心肌組織氧化應(yīng)激水平。2nahs通過抑制takotsubo心肌病大鼠心肌組織nox4、p67蛋白表達(dá),從而降低takotsubo大鼠心肌病氧化應(yīng)激損傷。3nahs減輕takotsubo心肌病大鼠心肌細(xì)胞的凋亡。第三部分硫化氫通過抑制p38mapk/nox4/ros通路減輕異丙腎上腺素引起的h9c2細(xì)胞損傷目的:以h9c2細(xì)胞作為研究對象,探討硫化氫對takotsubo心肌病的保護(hù)機(jī)制。方法:1細(xì)胞培養(yǎng)h9c2細(xì)胞以高糖dmem培養(yǎng)基培養(yǎng),內(nèi)含10%胎牛血清、青霉素100u/ml、鏈霉素100μg/ml。置于37℃、飽和濕度、5%co2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,ldh)釋放檢測細(xì)胞毒性h9c2細(xì)胞以5000個(gè)細(xì)胞/孔接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,細(xì)胞貼壁后,給予不同濃度的iso(10、50、100、200μm)處理2h,按照試劑盒說明書要求加入試劑,測定490nm處各孔的吸光度,計(jì)算ldh釋放百分率。以篩選出最小細(xì)胞損傷濃度,選擇iso100μm用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞給予不同濃度的nahs(10、50、100、200μm)預(yù)處理,觀察nahs對iso100μm處理的h9c2細(xì)胞的保護(hù)作用,篩選出最佳濃度,選擇nahs50μm用于后續(xù)試驗(yàn)。3cck8法檢測各組h9c2細(xì)胞活性對數(shù)生長期h9c2細(xì)胞以5000細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板。細(xì)胞貼壁后分別給予iso100μm處理2h;給予nahs50μm預(yù)處理30min后給予iso100μm處理2h。酶標(biāo)儀檢測在450nm波長處各孔的od值。4dhe染色檢測正常對照組、iso組及nahs+iso組h9c2細(xì)胞超氧陰離子的變化。5利用westernblot方法檢測正常對照組、iso組h9c2細(xì)胞以及nahs+iso組h9c2細(xì)胞nox4蛋白的表達(dá)。6利用westernblot方法檢測iso組h9c2細(xì)胞以及nahs+iso組h9c2細(xì)胞p38、p-p38、jnk、p-jnk、erk、p-erk蛋白的表達(dá)。7利用westernblot方法檢測給予p38抑制劑sb203580對iso組h9c2細(xì)胞nox4蛋白表達(dá)的影響。8利用westernblot方法檢測給予jnk抑制劑sb600125對iso組細(xì)胞nox4蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:1ldh釋放實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)h9c2細(xì)胞給予iso的濃度為100μm時(shí),細(xì)胞的ldh釋放最多,說明iso100μm對細(xì)胞的損傷較明顯,選擇iso100μm作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)濃度。2ldh釋放實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度的nahs均可以減輕iso對h9c2細(xì)胞損傷,其中nahs50μm的保護(hù)作用最為明顯,選擇nahs50μm用于后續(xù)試驗(yàn)。3 CCK8實(shí)驗(yàn)顯示NaHS預(yù)處理能夠升高ISO對H9c2細(xì)胞的活力。4 NaHS降低ISO引起的H9c2細(xì)胞超氧陰離子水平。5 NaHS預(yù)處理可降低ISO引起的H9c2細(xì)胞NOX_4蛋白表達(dá)6 NaHS預(yù)處理可降低ISO引起的H9c2細(xì)胞p-p38/p38、p-JNK/JNK蛋白表達(dá),NaHS及ISO不影響H9c2細(xì)胞pERK/ERK蛋白表達(dá)。7 p38抑制劑SB203580能夠降低ISO引起的H9c2細(xì)胞NOX_4蛋白表達(dá)8 JNK抑制劑SB600125不影響ISO引起的H9c2細(xì)胞NOX_4蛋白表達(dá)。結(jié)論:1 ISO可以引起H9c2細(xì)胞NOX_4蛋白表達(dá)增加,細(xì)胞超氧陰離子水平增加。NaHS可以抑制ISO引起的細(xì)胞NOX_4蛋白表達(dá)和超氧陰離子水平。2 ISO可以引起H9c2細(xì)胞p38蛋白表達(dá)增加和JNK蛋白表達(dá)增加,說明ISO引起p38MAPK通路和JNK通路激活。NaHS可以抑制ISO引起的p38MAPK通路和JNK通路激活。3 ISO是通過激活p38MAPK通路使NOX_4蛋白表達(dá)增加,引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,而不是通過激活JNK通路.4外源性硫化氫通過抑制p38MAPK/NOX_4/ROS通路對ISO引起的損傷發(fā)揮保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R542.2

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本文編號：1500643