本文關(guān)鍵詞： 腹主動脈瘤 巨噬細胞 KLF5 Myo9b Podosome RhoA　出處：《河北醫(yī)科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysms,AAA)是一種慢性炎癥性疾病,其病理特征是主動脈壁的重塑,常常由于主動脈夾層動脈瘤破裂而導致病人死亡。AAA的形成是與多種因素有關(guān),包括巨噬細胞的浸潤,炎性因子和蛋白酶的釋放,彈力纖維的斷裂,血管平滑肌細胞的凋亡,膠原蛋白降解等,其中巨噬細胞浸潤在AAA的發(fā)病機理中具有重要作用。研究已經(jīng)報道,慢性炎癥狀態(tài)(包括動脈粥樣硬化、氧化應(yīng)激、血管緊張素II和炎性細胞因子)激活單核/巨噬細胞,被激活的巨噬細胞滲透到血管壁并釋放蛋白酶,降解細胞外基質(zhì)成分,包括膠原蛋白和彈性蛋白;同時,浸潤進血管壁的巨噬細胞在血管中膜和外膜分泌炎性細胞因子,如:TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6,進一步加劇炎癥反應(yīng)。巨噬細胞浸潤至血管壁的過程需要肌動蛋白細胞骨架的重新組構(gòu)。在巨噬細胞浸潤過程中產(chǎn)生一種膜突出結(jié)構(gòu):偽足小體(podosome)。目前已知,多種細胞結(jié)蛋白和信號蛋白以肌絲蛋白為核心包裹行成的束狀podosome參與細胞的局部黏附和遷移。束狀podosome呈現(xiàn)為點狀的染色,壽命2-10 min左右,但在炎癥環(huán)境下,束狀podosome逐漸積聚變?yōu)榄h(huán)形podosome(稱為podosome rosette),這種結(jié)構(gòu)可持續(xù)數(shù)小時,持續(xù)進行細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)消化并促使細胞遷移。此外,podosome還包含多個信號蛋白,其中Rho A是podosome形成的一個關(guān)鍵信號分子。但是,目前關(guān)于podosome形成及其與巨噬細胞遷移的關(guān)系仍不清楚。Myo9b作為一種與肌絲蛋白相關(guān)的馬達蛋白,其分子中包含的Rho GAP蛋白結(jié)構(gòu)域具有抑制Rho信號的作用,因而能夠調(diào)節(jié)巨噬細胞的極性和遷移。盡管Myo9b在破骨細胞中表達并調(diào)節(jié)podosome形成已有報道,但是Myo9b與動脈瘤發(fā)生發(fā)展之間的聯(lián)系尚未闡明。人類Krüppel樣因子5(KLF5)屬于SP/KLF轉(zhuǎn)錄因子家族,其在羧基末端具有三個共同的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)。大量研究表明KLF5可以激活多種與心血管重塑相關(guān)的基因。已有報道,KLF5在大型未破裂的腦動脈瘤中高度表達,但是KLF5介導AAA形成的確切機制尚不清楚。在AAA形成過程中,KLF5與podosome形成和巨噬細胞浸潤的關(guān)系仍然未知。因此,本研究利用Ca PO4誘導的小鼠腹主動脈瘤模型和人AAA組織,探討Myo9b在KLF5介導的巨噬細胞podosome形成和巨噬細胞浸潤中的作用,旨在為闡明KLF5在動脈瘤中的作用機制提供實驗基礎(chǔ)。第一部分KLF5通過促進巨噬細胞的遷移參與腹主動脈瘤的形成目的:探討KLF5對巨噬細胞遷移的影響及其在AAA形成中的作用。方法:1通過實時定量PCR(q RT-PCR)和免疫組化檢測人AAA組織中KLF5的表達,免疫雙熒光共定位檢測KLF5在血管組織中巨噬細胞和VSMCs的表達。2構(gòu)建Ca PO4誘導的小鼠AAA模型,HE染色證實模型成功。q RT-PCR和免疫組化檢測小鼠AAA組織中KLF5的表達。免疫雙熒光共定位檢測KLF5在小鼠AAA組織巨噬細胞和VSMCs中的表達。3雜交培育骨髓源單核細胞KLF5基因特異性敲除小鼠并建立AAA模型。4 HE和EVG染色檢查血管組織和彈力纖維的變化。5免疫雙熒光共定位KLF5和巨噬細胞。結(jié)果:1人AAA組織中KLF5表達升高與人正常主動脈組織相比,人AAA組織中KLF5m RNA表達水平升高,免疫組化KLF5染色陽性細胞數(shù)增加。對巨噬細胞和平滑肌細胞標志物進行免疫熒光染色的結(jié)果顯示,在人AAA組織中巨噬細胞明顯增多,并且平滑肌細胞和巨噬細胞中KLF5表達均明顯增多,說明KLF5表達水平升高可能在AAA形成中發(fā)揮作用。2 Ca PO4誘導的小鼠AAA中KLF5表達水平增加在形態(tài)學檢查證實,用Ca PO4誘導成功建立小鼠AAA模型的基礎(chǔ)上,檢查KLF5在實驗型AAA組織中的表達變化。q RT-PCR結(jié)果顯示,KLF5m RNA表達水平隨著Ca PO4誘導天數(shù)的增加而升高,在第7天和第14天分別升高了2.39倍和2.14倍。免疫熒光染色結(jié)果證實,KLF5在巨噬細胞和VSMCs中均有表達,這與在人AAA組織中的檢測結(jié)果相同。這些結(jié)果表明,KLF5參與人和小鼠AAA的形成。3巨噬細胞特異性敲除KLF5能減緩Ca PO4誘導的小鼠AAA形成KLF5-flox小鼠和Lys M-cre小鼠雜交培育遺傳性敲除巨噬細胞中KLF5的小鼠(KLF5-/-),與野生型(WT)小鼠相比,KLF5-/-小鼠經(jīng)Ca PO4誘導的腹主動脈膨脹率顯著降低。HE染色結(jié)果顯示,KLF5-/-小鼠的腹主動脈組織結(jié)構(gòu)接近正常,彈力纖維斷裂與WT組比較明顯減少。結(jié)果顯示KLF5-/-小鼠腹主動脈的彈力纖維斷裂與WT組比較明顯減少。免疫熒光染色結(jié)果顯示,與WT組比較,在KLF5-/-小鼠的血管組織中,KLF5染色陽性巨噬細胞數(shù)量明顯減少。這些結(jié)果表明,KLF5通過促進巨噬細胞浸潤而參與AAA形成。小結(jié):KLF5在人和Ca PO4誘導的小鼠AAA組織中表達升高。KLF5在血管平滑肌細胞和巨噬細胞中均進行表達。巨噬細胞特異性敲除KLF5能夠減少巨噬細胞的浸潤,抑制Ca PO4誘導的小鼠AAA的形成。第二部分KLF5通過上調(diào)Myo9b表達促進巨噬細胞podosome的形成和遷移目的:揭示KLF5促進巨噬細胞遷移和浸潤的分子與細胞生物學機制。方法:1體外細胞劃痕實驗觀察WT和KLF5-/-巨噬細胞的遷移。2Transwell小室實驗觀察WT和KLF5-/-巨噬細胞的侵襲能力。3掃描電鏡觀察巨噬細胞跨膜遷移時細胞足突。4活細胞工作站觀察WT和KLF5-/-巨噬細胞的徑向運動變化。5 m RNA表達譜芯片檢測WT和KLF5-/-巨噬細胞的基因表達差異。6 q RT-PCR檢測細胞運動相關(guān)基因的表達。7在巨噬細胞中過表達和敲低KLF5后檢查運動相關(guān)基因的表達變化。8報告基因檢測KLF5對Myo9b基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。9 Oligo pull-down分析確定KLF5在Myo9b基因啟動子上的結(jié)合位點。結(jié)果:1 KLF5-/-巨噬細胞的遷移功能受損從KLF5-/-和WT小鼠分離培養(yǎng)骨髓源巨噬細胞,劃痕實驗結(jié)果表明,KLF5-/-巨噬細胞的遷移進入劃痕區(qū)域的細胞數(shù)量比WT巨噬細胞顯著減少。Transwell小室實驗證實,與WT巨噬細胞相比,KLF5-/-巨噬細胞的侵襲能力受損。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示,與WT巨噬細胞相比,KLF5-/-巨噬細胞具有更少、更短的突觸和偽足。細胞免疫雙熒光染色結(jié)果顯示,跨越濾膜的KLF5-/-巨噬細胞幾乎不表達KLF5。進一步用動態(tài)細胞成像技術(shù)觀察發(fā)現(xiàn),與WT巨噬細胞相比,KLF5-/-巨噬細胞的徑向遷移能力受損,遷移速率明顯降低。2 KLF5通過直接與Myo9b啟動子結(jié)合而上調(diào)Myo9b表達m RNA表達譜芯片檢測結(jié)果顯示,與WT組比較,KLF5-/-小鼠的運動相關(guān)基因在Ca PO4損傷的主動脈組織中表達顯著下降。Gene Ontology富集分析發(fā)現(xiàn),差異表達的基因主要集中于細胞Myosin肌絲和Myosin復合物等蛋白相關(guān)基因。q RT-PCR對芯片分析結(jié)果進行驗證,Myo9a、Myo9b和Macf1基因表達在KLF5-/-小鼠顯著下調(diào)。分別在Raw264.7中過表達或敲低KLF5,PCR和Western blotting結(jié)果均顯示,在基礎(chǔ)水平和TNF-α誘導情況下,在巨噬細胞中過表達或敲低KLF5均能夠顯著增加或降低Myo9a和Myo9b的m RNA和蛋白水平。報告基因和Oligo pull-down分析結(jié)果表明,KLF5通過直接與Myo9b啟動子上的TCE位點結(jié)合而激活Myo9b基因表達。3 KLF5缺失導致Myo9b表達下調(diào)及podosome形成減少免疫熒光染色結(jié)果顯示,Myo9b與podosome共定位。PDBu促進WT巨噬細胞形成podosome,但在PDBu處理的KLF5-/-巨噬細胞中podosome數(shù)量顯著減少。Podosome陽性細胞數(shù)在TNF-α誘導的WT巨噬細胞中顯著升高,但無論TNF-α誘導與否,KLF5-/-巨噬細胞中的podosome陽性細胞數(shù)均較少。Myo9b與Vinculin、Tks5或F-actin共定位的染色結(jié)果進一步證實,Myo9b定位于巨噬細胞的podosome中。Myo9a不與Cortactin和F-actin在podosome中共定位。在KLF5-/-巨噬細胞中過表達KLF5能夠恢復podosome的形成。體內(nèi)研究結(jié)果同樣證實,podosome結(jié)構(gòu)在人和小鼠AAA組織中與體外細胞中的結(jié)構(gòu)相似。小結(jié):KLF5在巨噬細胞中缺失造成細胞遷移功能受損。在巨噬細胞中,Myo9b是KLF5的直接靶基因,KLF5通過直接與Myo9b啟動子上的TCE位點相互作用激活Myo9b基因轉(zhuǎn)錄,KLF5缺失通過導致Myo9b表達下調(diào)而減少podosome形成。第三部分Myo9b通過負性調(diào)節(jié)Rho A信號促進巨噬細胞podosome的形成、遷移和AAA進展目的:探索KLF5及受其調(diào)控的Myo9b調(diào)節(jié)巨噬細胞podosome形成的分子機制。方法:1用si-RNA敲低巨噬細胞中內(nèi)源性Myo9b的表達,細胞免疫熒光染色觀察podosome的形成是否發(fā)生變化。2 Transwell小室實驗觀察Myo9b敲低對巨噬細胞侵襲能力的影響。3在Myo9b的巨噬細胞中過表達KLF5后經(jīng)免疫熒光染色觀察podosome的形成。4用TNF-α刺激巨噬細胞后,GTPase pull-down和Western blot檢測巨噬細胞中與GTP結(jié)合的Rho A、Cdc42和Rac1及其總蛋白水平。5在巨噬細胞中分別過表達或敲低KLF5,GTPase pull-down和Western blot檢測Rho A、Cdc42和Rac1的激活和Myo9b表達變化。6用上述方法檢查Rho A特異性抑制劑對巨噬細胞podosome形成和細胞遷移的影響。7免疫雙熒光染色和q RT-PCR檢測人AAA組織中Myo9b的表達和定位。結(jié)果:1 Myo9b敲低減少TNF-α誘導的巨噬細胞podosome的形成和遷移用Myo9b特異性si RNA(si-Myo9b)和非特異性si RNA(si-NS)轉(zhuǎn)染巨噬細胞,細胞免疫熒光染色結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染si-NS的細胞相比,在轉(zhuǎn)染si-Myo9b的細胞中PDBu誘導的podosome形成顯著減少,而且Myo9b敲低后,podosome的形成不再受TNF-α的影響。Transwell結(jié)果顯示,Myo9b敲低后,穿越濾膜的巨噬細胞的數(shù)目顯著低于轉(zhuǎn)染si-NS的細胞。反之,在巨噬細胞中過表達KLF5能夠促進podosome的形成,但是這種效應(yīng)在轉(zhuǎn)染si-Myo9b的巨噬細胞中被取消。2在巨噬細胞中KLF5敲低或缺失增加Rho A-GTP水平GTPase pull-down和Western blot結(jié)果顯示,在TNF-α刺激的巨噬細胞中,與GTP結(jié)合的Cdc42、Rac1和Rho A水平顯著增加,其中Rho A-GTP水平在30min達到峰值,6 h恢復至基礎(chǔ)水平。與此同時,伴隨著Rho A-GTP水平的下降,Myo9b的表達水平增加。在巨噬細胞中敲低或過表達KLF5后,經(jīng)GTPase pull-down和Western blot檢查Myo9b表達及Rho A-GTP水平的變化。結(jié)果表明,過表達KLF5顯著上調(diào)Myo9b的表達,并且減少Rho A-GTP的水平;敲低KLF5顯著下調(diào)Myo9b的表達,增加Rho A-GTP的水平。免疫熒光結(jié)果顯示,與Rhosin處理的WT巨噬細胞相比,KLF5-/-巨噬細胞經(jīng)Rhosin處理后,PDBu誘導形成的podosome數(shù)目顯著增多。Transwell結(jié)果顯示,與未經(jīng)處理的KLF5-/-巨噬細胞相比,Rhosin處理后細胞侵襲能力顯著增加。3在人組織中Myo9b表達上調(diào)并且定位于巨噬細胞免疫雙熒光染色結(jié)果顯示,人AAA組織中Myo9b的表達與正常組比較顯著升高,且主要定位于MAC2陽性的巨噬細胞。q RT-PCR結(jié)果表明,Myo9bm RNA水平在人AAA組織中顯著高于正常腹主動脈組織。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,KLF5m RNA水平與AAA的膨脹率的相關(guān)性并不明顯(P0.05),但是Myo9bm RNA水平與AAA的膨脹率具有顯著正相關(guān)性(P0.05)。小結(jié):敲低Myo9b能顯著減少TNF-α誘導的巨噬細胞podosome的形成和遷移。在巨噬細胞中,KLF5敲低或缺失增加Rho A-GTP的水平;KLF5通過上調(diào)Myo9b表達而抑制Rho A信號途徑以及podosome的形成。巨噬細胞中Myo9b表達上調(diào)與人AAA的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。結(jié)論:1 KLF5促使巨噬細胞遷移和動脈瘤形成。2在巨噬細胞中Myo9b是KLF5的直接靶基因。3 KLF5促進podosome形成和巨噬細胞遷移以及Myo9b的表達。4 Myo9b通過負性調(diào)節(jié)Rho A信號促進巨噬細胞podosome的形成、遷移和AAA進展。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R543.16

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