發(fā)布時(shí)間：2018-02-05 19:09

  本文關(guān)鍵詞： 尼可地爾 血管球囊拉傷 K_ATP~+通道 εPKC通路 Akt通路　出處：《中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：建立大鼠頸動(dòng)脈球囊拉傷模型、糖尿病大鼠模型,并體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞,從動(dòng)物-細(xì)胞-分子水平驗(yàn)證尼可地爾抑制大鼠頸動(dòng)脈球囊拉傷后內(nèi)膜增生并促進(jìn)再內(nèi)皮化的作用,為減少冠脈介入術(shù)后相關(guān)并發(fā)癥提供新的理論依據(jù)。方法：腹腔注STZ建立糖尿病大鼠模型并行頸動(dòng)脈球囊拉傷,分組：①假手術(shù)組(8只);②球囊拉傷組(10只);③尼可地爾組(10只);④尼可地爾-5HD共作用組(10只)。20只大鼠經(jīng)血管外膜轉(zhuǎn)染siRNA:NC siRNA組(10只);εPKC siRNA組(10只)。PCNA免疫組化染色分析細(xì)胞增殖；CD68免疫組化染色分析血管內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。培養(yǎng)原代VSMCs并分組：①對(duì)照組;②高糖組;③尼可地爾組;④尼可地爾-5-HD共處理組。VSMCs轉(zhuǎn)染NC siRNA或εPKC siRNA,并檢測(cè)細(xì)胞增殖與遷移。建立SD大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型,大鼠分為5組：①假手術(shù)組(10只);②球囊拉傷組(10只);③雷帕霉素組(20只);④雷帕霉素-尼可地爾共作用組(10只);⑤雷帕霉素-NAC共作用組(10只)。伊文思藍(lán)染色及CD31免疫熒光染色檢測(cè)血管再內(nèi)皮化程度。DHE染色檢測(cè)血管冰凍切片ROS水平。培養(yǎng)原代CMECs并分組：①對(duì)照組;②雷帕霉素組;③雷帕霉素-尼可地爾共處理組。于CMECs中轉(zhuǎn)染XOsiRNA,Akt siRNA及NC siRNA。FCM檢測(cè)Annexin V-FITC/PI染色細(xì)胞。酶標(biāo)儀檢測(cè)caspase 3活性。MTT法及BrdU試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖。劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移。FCM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DHE熒光強(qiáng)度。Western blot檢測(cè)血管中XO、εPKC蛋白及細(xì)胞水平XO、Akt、p-Akt、ePKC蛋白表達(dá)。qRT-PCR檢測(cè)eNOS mRNA的表達(dá)。結(jié)果：糖尿病大鼠球囊損傷后14d新生內(nèi)膜顯著增生,尼可地爾組內(nèi)膜增生減少,5-HD與尼可地爾共處理阻斷了尼可地爾抑制內(nèi)膜增生的作用。與球囊拉傷組糖尿病大鼠相比,尼可地爾組血管內(nèi)膜中CD68、PCNA陽(yáng)性細(xì)胞均減少。尼可地爾-5-HD共處理組大鼠血管新生內(nèi)膜中PCNA、CD68陽(yáng)性細(xì)胞較尼可地爾組增加。球囊拉傷組糖尿病大鼠頸動(dòng)脈εPKC蛋白轉(zhuǎn)位增加,尼可地爾抑制了εPKC蛋白轉(zhuǎn)位,5-HD阻斷了尼可地爾對(duì)頸動(dòng)脈εPKC蛋白轉(zhuǎn)位的抑制作用。經(jīng)血管外膜轉(zhuǎn)染εPKC siRNA后,內(nèi)膜增生被抑制,其中CD68、PCNA陽(yáng)性細(xì)胞均減少。高糖培養(yǎng)24h后,VSMCs增殖和遷移較對(duì)照組顯著。尼可地爾抑制了高糖誘發(fā)的VSMCs細(xì)胞增殖和遷移,尼可地爾-5-HD共處理組VSMCs增殖和遷移較尼可地爾組增強(qiáng)。與轉(zhuǎn)染NC siRNA的VSMCs相比,轉(zhuǎn)染εPKC siRNA的VSMCs細(xì)胞增殖和遷移也明顯下降。雷帕霉素組大鼠再內(nèi)皮化被抑制,尼可地爾可逆轉(zhuǎn)雷帕霉素造成的再內(nèi)皮化延遲。球囊拉傷組大鼠動(dòng)脈ROS上升,雷帕霉素組大鼠動(dòng)脈ROS進(jìn)一步上升,尼可地爾-雷帕霉素共處理使血管中ROS下降。NAC抗氧化應(yīng)激后,大鼠頸動(dòng)脈再內(nèi)皮化面積增加。球囊拉傷血管中XO蛋白升高,雷帕霉素使拉傷的頸動(dòng)脈中XO蛋白進(jìn)一步升高,雷帕霉素-尼可地爾共處理組大鼠頸動(dòng)脈中XO蛋白下降。另外,雷帕霉素-尼可地爾共處理組大鼠頸動(dòng)脈eNOS mRNA表達(dá)水平較雷帕霉素組上升。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),雷帕霉素誘導(dǎo)CMECs凋亡和ROS升高,雷帕霉素-尼可地爾共處理組CMECs凋亡率、caspase 3活性及ROS均較之下降。雷帕霉素干預(yù)后,轉(zhuǎn)染XO siRNA的CMECs凋亡率、caspase 3舌性及ROS均較轉(zhuǎn)染NC siRNA的CMECs降低。雷帕霉素抑制了CMECs增殖和遷移,而雷帕霉素-尼可地爾共處理使細(xì)胞增殖及遷移較之增強(qiáng)。雷帕霉素干預(yù)后,轉(zhuǎn)染XO siRNA的CMECs遷移及增殖均較轉(zhuǎn)染NC siRNA的CMECs增強(qiáng)。雷帕霉素抑制CMECs內(nèi)Akt磷酸化,雷帕霉素-尼可地爾共處理組細(xì)胞Akt磷酸化水平升高。CMECs中轉(zhuǎn)染Akt siRNA后eNOS mRNA表達(dá)被抑制。結(jié)論：1.尼可地爾抑制糖尿病大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜增生,并抑制細(xì)胞增殖和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。尼可地爾也抑制了高糖誘發(fā)的VSMCs增殖和遷移。2.尼可地爾開(kāi)放mitoK+ ATP通道來(lái)抑制εPKC通路激活,并通過(guò)該機(jī)制抑制糖尿病大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后新生內(nèi)膜增生、減少細(xì)胞增殖和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。3.尼可地爾促進(jìn)動(dòng)脈球囊拉傷后再內(nèi)皮化進(jìn)程,其與雷帕霉素共作用彌補(bǔ)了雷帕霉素在抑制內(nèi)膜增生的同時(shí)也抑制了再內(nèi)皮化的不足。4.在球囊損傷血管及CMECs中,雷帕霉素誘導(dǎo)了XO蛋白升高并促進(jìn)ROS生成。5.尼可地爾抑制了血管及CMECs中XO的升高,減少了XO來(lái)源的ROS：尼可地爾同時(shí)促進(jìn)了被雷帕霉素抑制的Akt/eNOS表達(dá)：從而減輕雷帕霉素誘導(dǎo)的CMECs凋亡和氧化應(yīng)激,促進(jìn)了CMECs的增殖和遷移,并促進(jìn)了再內(nèi)皮化。
[Abstract]:Objective: to establish rat carotid artery balloon injury model, the model of diabetic rats, and cultured vascular endothelial cells and vascular smooth muscle cells from animal cell molecular level verification of nicorandil inhibits balloon injury of rat carotid artery intimal hyperplasia and promote endothelialization effect, provide a theoretical basis for new complications of intervention after the reduction of coronary artery. Methods: intraperitoneal injection of STZ to establish the model of diabetic rats carotid artery balloon injury, divided into two groups: sham operation group (8 rats); the balloon injury group (10 rats); the nicorandil group (10 rats); the total effect of nicorandil -5HD (10 rats) group.20 rats by blood vessel the outer membrane was transfected into siRNA:NC (10) siRNA group; siRNA Group E PKC (10).PCNA immunohistochemical analysis of cell proliferation; CD68 immunohistochemical analysis of inflammatory cell infiltration. Intravascular VSMCs were cultured and divided into groups: control group, high glucose; 緇，

本文編號(hào)：1492522