本文關(guān)鍵詞： 胸主動脈夾層 非編碼RNA 環(huán)狀RNA 芯片 生物信息學(xué)　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景和目的:胸主動脈夾層(thoracic aortic dissection,TAD)是致命的主動脈疾病之一,盡管隨著診斷與治療技術(shù)的提高,高血壓、動脈粥樣硬化、吸煙等危險因素的嚴(yán)格控制,TAD的發(fā)病率和死亡率仍然較高。面對如此臨床困境,仍然沒有預(yù)防TAD形成與進(jìn)展的藥物治療方法,主要是我們對TAD的發(fā)病分子機(jī)制不清楚,既往的基因研究關(guān)注有遺傳背景TAD的致病基因即編碼平滑肌細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)基因的變異,在一定程度上解釋了 TAD的發(fā)病機(jī)制,而關(guān)于散發(fā)型TAD研究較少,雖然從蛋白組織學(xué)及基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)了散發(fā)型TAD差異表達(dá)基因,但對差異表達(dá)基因的上游調(diào)控研究較少。近來,非編碼RNA特別環(huán)狀RNA(CircularRNAs,CircRNAs)是新發(fā)現(xiàn)的基因表達(dá)的調(diào)控因子。本研究旨在從CircRNAs的角度探討急性A型TAD的可能發(fā)病機(jī)制。材料和方法:1.收集2015年在廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院和中山市人民醫(yī)院心外科行手術(shù)治療的急性A型TAD血管標(biāo)本及心臟移植供體心臟的正常升主動脈標(biāo)本各6例。用HE染色和免疫組化研究升主動脈血管的病理特點(diǎn)。2.應(yīng)用NanoDropND-1000檢測納入芯片實(shí)驗(yàn)的6例標(biāo)本(各3例)中RNA的質(zhì)量。對符合條件6例標(biāo)本進(jìn)行Arraystar Human CircRNA芯片檢測,利用Agilent Feature Extraction軟件提取微陣列的圖像中的訊息,利用Gene Spring GX軟件標(biāo)準(zhǔn)化處理和評估CircRNA原始表達(dá)訊息。3.利用兩分類法進(jìn)行差異CircRNAs的篩選,火山圖及聚類圖展示TAD組織中差異CircRNAs的情況。對TAD組織中差異CircRNAs的來源基因進(jìn)行Go分析,用Arraystar公司的miRNA結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測軟件預(yù)測差異CircRNAs的5個高匹配值的miRNA結(jié)合位點(diǎn),對差異CircRNAs預(yù)測結(jié)合的與TAD相關(guān)的miRNAs的已驗(yàn)證靶基因進(jìn)行pathway分析。應(yīng)用GCBI網(wǎng)站查找miRNA的靶基因。用Cytoscape軟件對差異CircRNAs與對應(yīng)的5個高匹配值結(jié)合位點(diǎn)的miRNAs、至少含有一個TAD相關(guān)的miRNA的CircRNA/miRNA以及選取結(jié)合TAD相關(guān)的miRNA 數(shù)目最多的 hsa_circRNA_101238 進(jìn)行 circRNA/miRNA 或circRNA/miRNA/mRNA 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建。4.采用實(shí)時熒光定量PCR對CircRNA芯片結(jié)果中上調(diào)的hsa_circRNA_101238、hsa-_circRNA_104634、hsa-_circRNA_002271、hsa-_circRNA-_102771、hsa-_circRNA_104349,下調(diào)的 hsa_circRNA_102683、hsa_circRNA_005525、hsa-_circRNA_103458,線性基因 COL1A1、COL6A3,FLNA 以及hsa-_circRNA-_101238預(yù)測結(jié)合的hsa-miR-320a的水平進(jìn)行驗(yàn)證;蛋白免疫印跡檢測hsa-miR-320a的靶基因基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)。結(jié)果:1.HE染色示正常升主動脈具有完整血管結(jié)構(gòu),TAD患者升主動脈大體標(biāo)本可見夾層撕裂內(nèi)膜破口的位置,光鏡下,血管結(jié)構(gòu)不完整,可見大量的血細(xì)胞成份浸潤。免疫組化提示MMP9在TAD組中膜表達(dá)明顯增加。2.選取的6例急性A型TAD血管與正常升主動脈的標(biāo)本均符合CircRNA芯片檢測的要求。3例A型TAD血管中的RNAOD 260/280的比值分別是1.9、1.89、1.87,3例正常的升主動脈中的RNAOD 260/280的比值分別是1.89、1.89、1.93,所有OD 260/280的比值都大于1.8,而且在1.8-2.1之間,符合實(shí)驗(yàn)的基本要求。以Cy3熒光染料對升主動脈標(biāo)本中的RNA標(biāo)記,特異性的標(biāo)記活性為(pmol per uldye)/(ug per ul cRNA),TAD1、TAD2、TAD3 標(biāo)記效率分別是 23.2、22.5、23.5,NA1、NA2、NA3標(biāo)記效率分別為23.6、22.5、22.3,符合實(shí)驗(yàn)的要求。3.對CircRNA芯片檢測的初始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和低表達(dá)的訊息進(jìn)行過濾后,上述升主動脈標(biāo)本共檢測到CircRNA8173個;CircRNA標(biāo)準(zhǔn)化后數(shù)值的質(zhì)量評估:箱形圖的結(jié)果分析顯示TAD血管與正常血管的CircRNA在各組表達(dá)水平的平均值大約在一個水平,數(shù)據(jù)中間50%的范圍值的一致性良好,散點(diǎn)圖的結(jié)果提示TAD的血管較正常的主動脈存在著大量差異的CircRNAs。4.Volcano Plots的分析檢測得到差異的CircRNAs 262個,其中TAD升主動脈中上調(diào)的156個,下調(diào)的106個。Go分析結(jié)果顯示,TAD升主動脈中上調(diào)circRNAs的線性基因富集總分排名前10的包括negative regulation of cell proliferation,extrcellular matrix organization 等;TAD 升主動脈中下調(diào) circRNAs 的線性基因富集總分排名前 10 的包括:actomyosin structure organization,cytoskeleton organization,cell cycle process,actin cytoskeleton organization,actin filament-based prosess 等。5.在CircRNA/miRNA的注釋中,差異的262個CircRNAs預(yù)測結(jié)合1286個miRNAs,其中包含28個與TAD相關(guān)的miRNAs,對這28個miRNAs的已驗(yàn)證靶基因進(jìn)行pathway分析結(jié)果顯示富集總分排名前10的信號通路包括focal adhension,regulation of actin cytoskeleton,vascular smooth muscle contraction 等。6.在circRNA/miRNA網(wǎng)絡(luò)圖中,這28個miRNAs對應(yīng)結(jié)合33個CircRNAs中,其中結(jié)合TAD相關(guān)的miRNAs數(shù)目最多的是hsa_circRNA_101238,包括hsa-miR-320a,hsa-miR-320b,hsa-miR-320c;在 circRNA/miRNA/mRNA 構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)圖中,有46個預(yù)測的與TAD相關(guān)的靶基因,包括hsa-miR-320a的靶基因 MMP9。7.實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示,與正常升主動脈相比,在TAD中hsa-_circRNA_l 01238,hsa-_circRNA_104634,hsa-_circRNA__002271,hsa-_circRNA-_102771,hsa_circRNA-_104349,COL1A1,COL6A3 分別上調(diào)3.41,2.96,2.11,2.67,2.6,3.11,2.03 倍,而 hsa_circRNA_102683,hsa_circRNA_005525,hsa_circRNA_103458,FLNA,hsa-miR-320a 分別下調(diào) 5.88,5.0,2.94,2.38,2.0倍;WB結(jié)果示在TAD升主動脈中MMP9升高1.8倍。結(jié)論:1.TAD升主動脈中層撕裂,血栓形成,存在細(xì)胞外基質(zhì)降解。2.與NA相比,TAD的升主動脈存在大量異常表達(dá)的CircRNAs,并且與調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)、平滑肌細(xì)胞丟失病理過程相關(guān)。3.CircRNAs可能通過調(diào)節(jié)親本基因或作為miRNA海綿分子作用參與TAD的發(fā)生發(fā)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R543.1

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本文編號：1483128