本文關鍵詞：神經(jīng)生長因子在離體大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用及其非神經(jīng)機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《重慶醫(yī)科大學》 2013年

神經(jīng)生長因子在離體大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用及其非神經(jīng)機制的研究

敖麗  

【摘要】：目的通過檢測神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）在大鼠離體心臟缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，I/R）不同損傷程度的表達變化，進一步研究不同濃度外源性神經(jīng)生長因子β對心臟缺血再灌注損傷的影響，并給予PI3K-Akt通路的阻斷劑，以期探討神經(jīng)生長因子與大鼠心臟缺血再灌注損傷程度的關系、作用及可能機制。 方法 第一部分健康SPF級雄性SD大鼠48只，8~10周齡，體重200~300g，制備離體Langendorff心臟灌注模型后，采用隨機數(shù)字表法，將離體心臟隨機分為6組(n=8)：假手術組（S組）、缺血組（I組）、缺血再灌注組（I/R組）、神經(jīng)生長因子0.025組（N0.025組）、神經(jīng)生長因子0.1組（N0.1組）、神經(jīng)生長因子0.4組（N0.4組）。各組均先用K-H液平衡灌注20min，S組用K-H液繼續(xù)灌注180min；I組灌注K-H液30min，停灌30min；缺血再灌注組灌注K-H液30min，停灌30min，復灌120min；N0.1組用含有0.1ng/ml神經(jīng)生長因子的K-H液繼續(xù)灌注20min，再用K-H液沖洗10min，停灌30min，復灌120min；N0.025組和N0.4組灌注液中的神經(jīng)生長因子濃度分別為0.025、0.4ng/ml，灌注方式同N0.1組。待心臟跳動穩(wěn)定后，于左心耳處插入乳膠水囊至左心室，用SCW-PTO1型壓力傳感器與RM6240B型多通道信號采集處理系統(tǒng)在平衡灌注末（T1）、停灌前即刻(T3)及再灌后5min (T4)、30min (T5)、60min (T6)、120min (T7)時記錄各組的心率（HR）、左室舒張末壓(LVEDP)、左室發(fā)展壓(LVDP)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)。在T1、T4、T5、T6、T7各時間點收集冠脈流出液，測定肌酸激酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)的水平，并于再灌注末取心肌組織，TUNEL法檢測細胞凋亡，計算凋亡指數(shù)。用Western-blot法檢測S組、I組、I/R組左心室前壁的神經(jīng)生長因子的表達；逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測其NGF mRNA的表達。 第二部分健康SPF級雄性SD大鼠32只，鼠齡8~10周，體重200~300g，制備離體Langendorff心臟灌注模型后，采用隨機數(shù)字表法，將離體心臟隨機分為4組(n=8)：對照組（缺血再灌注組，即I/R組）、NGF預處理組（N組）、LY294002組（L組）、NGF+LY294002組（N+L組）。各組先用K-H液平衡灌注20min。隨后對照組K-H液繼續(xù)灌注60min，停灌30min，復灌120min；N組用含有0.1ng/mlNGF的K-H液繼續(xù)灌注20min，K-H液灌注40min，再停灌30min，再灌注120min；L組用含有LY294002（1.5mg/kg）的K-H液持續(xù)灌注20min，再用K-H液灌注40min，停灌30min，復灌120min；N+L組先用含有LY294002（1.5mg/kg）的K-H液持續(xù)灌注20min，K-H液沖洗10min后再用含有0.1ng/ml神經(jīng)生長因子的K-H液繼續(xù)灌注20min，K-H液沖洗10min，停灌30min，再灌注120min。分別在平衡灌注末（T1）、灌注30min和60min（T2、T3）以及再灌注5（T4）、30（T5）、60（T6）和120min（T7）時記錄各組的心功能指標（同第一部分）。在T1、T2、T4、T5、T6、T7各時間點收集冠脈流出液，測定肌酸激酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)的水平。用酶聯(lián)免疫法檢測再灌注末左心室前壁處心肌組織的丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）；一部分左心室前壁處心肌組織用TUNEL法檢測細胞凋亡，，計算凋亡指數(shù)；另一部分左心室前壁處心肌組織采用Western-blot法檢測不同組別Akt、pAkt、GRP78的表達；逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測各組Akt mRNA、GRP78mRNA表達。 結果 第一部分與平衡灌注末相比，I/R組再灌注5min、再灌注30min的LVDP、HR、+dp/dtmax降低，LVEDP升高(P0.05)，而S組四者在以上三個時間點無統(tǒng)計學差異；與S組相比，I/R組再灌注5min、再灌注30min的LVDP、+dp/dtmax和HR降低，LVEDP升高(P0.05)。與S組相比，I組和I/R組的LDH、CK升高(P0.05)，以及NGF蛋白含量和NGF mRNA降低(P＜0.05)；與I組相比，I／R組心肌組織NGF蛋白和NGF mRNA減少(P0.05)。與T1時間點比較，I/R組、N0.025、N0.1組、N0.4組的T4、T5、T6、T7時LVDP、+dp/dtmax降低，LVEDP升高，而I/R組、N0.025組和N0.4組HR降低，N0.1組HR升高(P0.05)；與I/R組相比，N0.1組T3、T4、T5、T6、T7時LVDP、+dp/dtmax和HR上升，LVEDP降低(P0.05)，N0.025組LVEDP在T1、T3、T4、T5、T6、T7差異均無統(tǒng)計學意義，HR在T3、T4下降，T1、T5、T6差異無統(tǒng)計學意義，LVDP和+dp/dtmax在T3、T4、T5、T6、T7下降，T1差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)，N0.4組T3、T4、T5、T6、T7時LVDP、+dp/dtmax降低，LVEDP上升(P0.05)，T1時各指標變化差異無統(tǒng)計學意義。與N0.1組相比，N0.025組和N0.4組T3、T4、T5、T6、T7時LVDP、+dp/dtmax和HR降低，LVEDP升高(P0.05)。與I/R組比較，N0.1組冠脈流出液CK、LDH在T4、T5、T6、T7四個時間點均降低，N0.025組T5、T6、T7三個時間點均升高，N0.4組T4、T5、T6、T7四個時間點均升高(P0.05)。各組T5時冠脈流出液CK、LDH濃度最高，隨后逐漸降低。與對照組比較N0.1組細胞凋亡指數(shù)降低(P0.05)，N0.025組差異無統(tǒng)計學意義，N0.4組升高(P＜0.05)。 第二部分除了N組，其余各組，與T1時比較，T4、T5、T6、T7各組LVDP、 HR和+dp/dtmax均降低，LVEDP升高(P0.05)，N組LVDP、 HR和+dp/dtmax均升高，LVEDP降低(P0.05)。與I/R組相比，N0.1組T2、T3、T4、T5、T6、T7時LVDP、+dp/dtmax和HR上升，LVEDP降低(P0.05)；N+L組T3時刻LVDP、+dp/dtmax和HR上升，LVEDP降低(P0.05)，其余各時點差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)；而L組各指標差異無統(tǒng)計學意義。與N組相比，各組HR、LVDP、+dp/dtmax在T2、T3、T4、T5、T6、T7時刻均降低，LVEDP上升(P0.05)。與T1相比較，四組各組的冠脈流出液CK、LDH濃度在T4、T5、T6、T7均上升，且T5時均達到最高，隨著再灌注時間的延長，濃度逐漸降低。與I/R組比較，N組冠脈流出液CK、LDH濃度在T2、T3、T4、T5、T6、T7時間點均降低；N+L組冠脈流出液CK、LDH濃度在T3時間點降低，其余時間點差異無統(tǒng)計學意義；L組無統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與I/R組比較，N組心肌組織SOD濃度升高，MDA濃度下降(P＜0.05)；L組和N+L組差異無統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與I/R組比較，N組凋亡指數(shù)均降低；L組和N+L組無統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。相對于I/R組，N組Akt、pAkt、GRP78蛋白表達量和Akt mRNA升高(P＜0.05)，GRP78mRNA變化無統(tǒng)計學意義；L組四者蛋白表達和基因變化均無統(tǒng)計學意義；N+L組的Akt、pAkt、GRP78蛋白表達量和Akt mRNA下降(P＜0.05)。 結論⑴大鼠離體心肌缺血再灌注損傷模型中NGF的表達量與損傷程度有關，其表達越低，損傷越嚴重。⑵0.1ng/ml的外源性神經(jīng)生長因子預處理可減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，0.4ng/ml時反而會加重心肌損傷。⑶外源性神經(jīng)生長因子預處理能激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應，降低心肌細胞凋亡水平，PI3K／Akt信號通路通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激參與了其保護作用。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R541
【目錄】：

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