本文關(guān)鍵詞：核因子-κB途徑介導(dǎo)硫酸吲哚酚抑制THP-1源性巨噬泡沫細(xì)胞B類1型清道夫受體的表達(dá)　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：一、背景研究人員逐漸認(rèn)識(shí)到,慢性腎臟疾病(chronic kidney disease, CKD)是心血管疾病患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,而心血管疾病也是慢性腎臟疾病的主要死亡原因之一。盡管近年來心血管疾病的病理生理和治療技術(shù)取得了很大進(jìn)步,慢性腎臟疾病仍然是全球性健康問題。即使在接受血液透析的情況下,腎衰竭患者心血管事件仍在增加,而心腎綜合征的機(jī)制至今仍不清楚。研究顯示,冠心病高發(fā)于慢性腎臟疾病人,透析患者心血管相關(guān)死亡是普通人群的十到30倍,慢性腎臟疾病進(jìn)展期的心血管疾病發(fā)病率及死亡率高于終末期腎臟疾病。在CKD人群中,心力衰竭(heart failure, HF)是最常見的臨床癥狀,而代償性尿毒癥性心肌病,如左室肥厚,則是心血管死亡的預(yù)測(cè)因素。即使在輕至中度的CKD中,腎小球?yàn)V過率仍與心血管事件的發(fā)生及死亡負(fù)相關(guān)。CKD患者存在多種尿毒癥毒素,不僅加重了腎臟疾病的損害,在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病重要基礎(chǔ),可見只要控制甚至預(yù)防它的發(fā)病可以延長(zhǎng)慢性腎臟疾病患者的壽命和提高其生活質(zhì)量。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)的機(jī)制十分復(fù)雜,是多種因素共同作用的一個(gè)長(zhǎng)期演變過程[13]。動(dòng)脈粥樣硬化尤其是高膽固醇血癥的AS,其可能機(jī)制是單核／巨噬細(xì)胞與損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附,遷入內(nèi)皮細(xì)胞下,并開始吞噬脂質(zhì),轉(zhuǎn)化為巨噬泡沫細(xì)胞。膽固醇不能在巨噬泡沫細(xì)胞內(nèi)經(jīng)氧化還原后排出,巨噬泡沫細(xì)胞排出膽固醇主要依賴自由擴(kuò)散和B類1型清道夫受體(SR-B1)等參與的逆轉(zhuǎn)運(yùn)。已有研究證實(shí),SR-B1是HDL中膽固醇及膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)的重要受體,參與體內(nèi)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程,發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。而核因子NF-κB信號(hào)是SR-B1 mRNA轉(zhuǎn)錄過程重要的調(diào)節(jié)因子,抑制SR-B1 mRNA的表達(dá)。硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate,IS)是蓄積于尿毒癥患者體內(nèi)最豐富的吲哚類化合物,屬蛋白結(jié)合類毒素,主要經(jīng)腎臟有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(OAT)排泄。尿毒癥患者由于腎功能衰竭,不能將其有效地排出而蓄積于體內(nèi),產(chǎn)生一系列病理變化。研究證實(shí),硫酸吲哚酚與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),具體機(jī)制不明確。但有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IS可激活NF-κB,作為細(xì)胞因子激活的始動(dòng)因子,進(jìn)而誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化。據(jù)以上分析,本文通過研究IS對(duì)THP-1源性巨噬泡沫細(xì)胞SR-B1表達(dá)的影響以及在NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的可能作用,探討尿毒癥毒素IS在動(dòng)脈粥樣硬化的作用及機(jī)制。二、目的觀察尿毒癥毒素硫酸吲哚酚(IS)是否促進(jìn)巨噬泡沫細(xì)胞脂滴的蓄積,以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)B類1型清道夫受體(SR-B1)表達(dá)和核因子NF-κB活化的影響。三、方法THP-1人單核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和傳代是按照美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)的說明進(jìn)行的,將THP-1細(xì)胞置于10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。細(xì)胞復(fù)蘇后,于含160n mol/LPMA無血清的RMMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h,使THP.1單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。棄掉上述巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基,與5Omg/L ox-LDL,共同孵育48h,使之轉(zhuǎn)發(fā)為泡沫細(xì)胞,油紅O染色鑒定細(xì)胞。巨噬泡沫細(xì)胞分化培養(yǎng)成功后,加入無血清的RPMI1640培養(yǎng)基,1h后加入IS干預(yù),使IS的終濃度分別為0、2.5、25、250μmol/L。取細(xì)胞,Trizol法提取出總RNA,并檢測(cè)其完整性。根據(jù)RT-PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)。引物設(shè)計(jì)：SR-B1的上游引物：5’-GGAACTTCTGGGCAAATGTG-3',下游引物：5-CTTCGTTGGGTGGGTAGATG-3',擴(kuò)增片段為112bp；反應(yīng)體系為201μL,反應(yīng)條件為：50℃2min,95℃30s,95℃5s,60℃34s,40個(gè)循環(huán)。取擴(kuò)增產(chǎn)物5ul與上述緩液混合混合進(jìn)行2%瓊脂凝膠電泳,并與標(biāo)準(zhǔn)分子量比較,鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。取各組細(xì)胞,按照試劑盒說明書提取總蛋白。BCA法測(cè)量蛋白濃度。將提取的蛋白溶液與5x上樣buffer按5：1比例混合均勻,配置電泳膠,進(jìn)行電泳分離、轉(zhuǎn)膜、4℃封閉孵育過夜,次日加一抗37℃孵育2h,TBST和蒸餾水漂洗后加二抗37℃孵育1h,再次TBST和蒸餾水漂洗后將雜交膜置于透明塑料板上,將化學(xué)熒光發(fā)光底物均勻加到膜表面反應(yīng)5 min后將膜放至暗盒進(jìn)行顯影。使用Labworks分析系統(tǒng)計(jì)算各蛋白條平均光度和面積灰度值,進(jìn)行相對(duì)定量分析。為進(jìn)一步檢測(cè)IS刺激THP-1源性巨噬泡沫細(xì)胞導(dǎo)致SR-B1 mRNA抑制的可能信號(hào)通路,本實(shí)驗(yàn)對(duì)SR-B1 mRNA轉(zhuǎn)錄過程中有重要影響的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。干預(yù)方法同前,樣品準(zhǔn)備：貼壁培養(yǎng)細(xì)胞,吸走細(xì)胞的所有培養(yǎng)基,用PBS大致清洗,向培養(yǎng)在96孔板的細(xì)胞每孔加100μL新鮮配制的1x裂解緩沖液溶解細(xì)胞,在室溫情況下震蕩(3000 rpm)細(xì)胞10分鐘。使用NF-κB ELISA試劑盒檢測(cè)裂解液中NF-κB蛋白水平,測(cè)量450nm處的各樣本吸光光度值,用此表示NF-κB活化的程度。將細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板,泡沫細(xì)胞成功誘導(dǎo)后,各組分別給予0、5、10、20、40μmol/L PDTC,預(yù)先孵育1h,再給予250 μmol/L的IS孵育3h,設(shè)加入等量PBS培養(yǎng)液的泡沫細(xì)胞設(shè)為空白對(duì)照組。攝取各組細(xì)胞總RNA后實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)S R-B1ml RNA的表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。檢測(cè)的結(jié)果以X±S表示,用SPSS13.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四、結(jié)果如已有文獻(xiàn)記載,本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)PMA處理后,細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則形貼壁生長(zhǎng),多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)偽足,分化為巨噬細(xì)胞,加入膽固醇和50mg/L ox-LDL共同培養(yǎng)24小時(shí),油紅O染色示細(xì)胞中形成大量的紅色脂質(zhì)顆粒,符合巨噬泡沫細(xì)胞的形態(tài)。與對(duì)照組(IS為Oμmol/L)比較,IS干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯增加,隨著IS濃度的升高,細(xì)胞內(nèi)脂滴逐漸增加。與對(duì)照組相比,細(xì)胞在不同濃度分組的IS(2.5 、25、250μmol/L)處理下,SR-B1 mRNA的表達(dá)下降(依次是1±0.14、0.44±0.04、0.14±0.02、0.06±0.01),隨著IS濃度的增加,SR-B1蛋白逐漸減少,呈現(xiàn)濃度依賴性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。取各組細(xì)胞的總蛋白進(jìn)行western blotting檢測(cè)。與對(duì)照組對(duì)比,經(jīng)過不同濃度各組IS (2.5、25、 250μmol/L)處理后,SR-B1蛋白表達(dá)下降(SR-B1/β-actin依次為0.65、0.48、0.32、0.28),隨IS濃度的升高,SR-B1蛋白的表達(dá)逐漸下降,呈現(xiàn)濃度依賴性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。檢測(cè)IS處理后各實(shí)驗(yàn)組泡沫細(xì)胞NF-κB活化程度,結(jié)果表明IS干預(yù)后巨噬泡沫細(xì)胞的NF-κB活化程度增高(依次是1.61±0.02、1.7±0.02、1.8±0.06、2.34±0.02),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與對(duì)照組相比,濃度250μmol/L的IS處理下,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SR-B1 mRNA的表達(dá),可見SR-B1 mRNA明顯下降,下降達(dá)94%。在濃度為250μmol/L的IS組中,不同濃度(0、5、10、20、40μmol/L) PDTC預(yù)處理后SR-B1mRNA表達(dá)增加(依次是1±0.04、2.95±0.19、5.88±0.29、8.71±0.78、19.65±0.31),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。五、結(jié)論心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)是尿毒癥的主要并發(fā)癥之一,是慢性腎臟病(hronic kidney disease, CKD)的主要死亡原因。研究發(fā)現(xiàn),CKD患者存在多種尿毒癥毒素[13],不僅加重腎臟功能的損害,還促進(jìn)CVD的發(fā)生、發(fā)展,硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate, IS)就是其中之一。IS是一種蛋白結(jié)合型小分子化合物,腎功能衰竭時(shí)在體內(nèi)蓄積,成為一種尿毒癥毒素。其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成的具體影響尚不清楚。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)形成的機(jī)制十分復(fù)雜,是多種因素共同作用的一個(gè)長(zhǎng)期演變過程[14]。動(dòng)脈粥樣硬化尤其是高膽固醇血癥的AS,其機(jī)制可能是單核/巨噬細(xì)胞與損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附,遷入內(nèi)皮細(xì)胞下,并開始吞噬脂質(zhì),轉(zhuǎn)化為巨噬泡沫細(xì)胞[15]。膽固醇不能在巨噬泡沫細(xì)胞內(nèi)經(jīng)氧化還原后排出,巨噬泡沫細(xì)胞排出膽固醇主要依賴自由擴(kuò)散和SR-B1等參與的逆轉(zhuǎn)運(yùn)[16]。已有研究證實(shí),SR-B1是HDL中膽固醇及膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)的重要受體,參與體內(nèi)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程,發(fā)揮抗AS的作用。本實(shí)驗(yàn)以THP.1源性巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象發(fā)現(xiàn),IS預(yù)處理后SR-B1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均受到抑制,細(xì)胞內(nèi)脂滴蓄積的數(shù)量增加,250μmol/L IS處理時(shí)SR-B1 mRNA表達(dá)下調(diào)達(dá)94%,表明IS促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成可能與SR-B1表達(dá)抑制有關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn),NF-κB是IS促進(jìn)CKD發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制之一[17],本實(shí)驗(yàn)IS處理時(shí)細(xì)胞NF-κB活化增加,250μmol/L IS處理時(shí)增加45.3%。NF-κB作為一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子,它參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞,調(diào)控多種基因的表達(dá),它的異常激活可促進(jìn)腎纖維化[18]。纖維化是各種腎臟疾病進(jìn)展至終末期常見的病理改變。而我們知道,CKD與AS同樣關(guān)系密切[19]。據(jù)此,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),用NF-κB抑制劑PDTC預(yù)處理后,IS對(duì)SR-B1 mRNA表達(dá)的抑制得到了明顯逆轉(zhuǎn),在40μmol/L處理時(shí),SR-B1 mRNA表達(dá)恢復(fù)至94.3%,證實(shí)了NF-κB活化是IS抑制SR-B1 mRNA表達(dá)的信號(hào)通路之一。綜上所述,Is抑制SR-B1的表達(dá),增加THP-1源性巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇的蓄積,促進(jìn)巨噬細(xì)胞泡沫化,NF-κB活化是IS抑制SR-B1 mRNA表達(dá)的信號(hào)通路之一。新的發(fā)現(xiàn)將在動(dòng)脈粥樣硬化,特別是心血管疾病發(fā)生發(fā)展研究中提供理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R692;R54

【共引文獻(xiàn)】

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1 鄭璐;載脂蛋白M對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響及其與冠心病的易感性[D];蘇州大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：1354582