本文關(guān)鍵詞：血清MiR-135b-5p和MiR-499a-3p在動(dòng)脈粥樣硬化中功能機(jī)制的初步研究　出處：《山東大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：動(dòng)脈粥樣硬化是一種涉及多種生理、生化和病理變化的慢性復(fù)雜疾病。血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)和平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的異常增殖和遷移在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著核心作用。最近研究顯示,某些circulating miRNA可以穩(wěn)定存在于外周循環(huán)系統(tǒng)中,并且具有心血管疾病標(biāo)志物的特征。但是,針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中,血清miRNA的變化情況及其參與血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞功能異常的分子機(jī)制研究目前知之甚少。本課題首先比較了13位冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者和5位健康對(duì)照樣本的血清miRNA表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)36種miRNA存在顯著性差異。隨后從中選取了13個(gè)miRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),并針對(duì)差異顯著的miR-135b-5p和miR-499a-3p在較大樣本中進(jìn)一步分析。在確認(rèn)miR-135b-5p和miR-499a-3p在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中異常增高后,本課題針對(duì)這兩種miRNA可能的分子功能機(jī)制開展了初步研究。相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-135b-5p和miR-499a-3p抑制下游靶基因MEF2C(肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C)表達(dá),促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。本課題研究結(jié)果為揭示miRNA在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的功能及分子機(jī)制提供了一定的科學(xué)線索和理論依據(jù)。研究目的本課題主要研究動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中miR-135b-5p和miR-499a-3p的表達(dá),并探索兩種miRNA對(duì)下游靶基因MEF2C的調(diào)控作用。同時(shí)探討miR-135b-5p和miR-499a-3p通過MEF2C對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移等細(xì)胞行為的作用。研究方法1、血清中miRNA的獲�。菏占�5m1動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血,加入促凝劑,分離血清。利用Trizol分離方法,獲取血清中miRNA.2、測(cè)定動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中miRNA的水平：利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)miR-135b-5p和miR-499a-3p的特異性引物,通過Real-Time PCR檢測(cè)兩種miRNA的表達(dá)。3、熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建：利用PCR技術(shù)擴(kuò)增包含結(jié)合位點(diǎn)的MEF2C3’UTR區(qū)域,并將該區(qū)域連入熒光素酶報(bào)告載體,利用雙熒光素酶報(bào)告試劑盒檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化。4、Western blot:在HEK293和HUVEC細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-135b-5p和miR-499a-3p的mimics或inhibitors。利用蛋白裂解液裂解細(xì)胞收集蛋白后,通過ECL試劑盒檢測(cè)蛋白表達(dá)。5、增殖實(shí)驗(yàn)：利用EDU試劑盒檢測(cè)miR-135b-5p和miR-499a-3p對(duì)HUVEC和VSMC細(xì)胞增殖的影響。6、遷移實(shí)驗(yàn)：利用Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-135b-5p和miR-499a-3p對(duì)HUVEC和VSMC遷移的影響。7、免疫組化實(shí)驗(yàn)：利用DAB試劑盒檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊處和周圍血管壁處MEF2C的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中miRNA表達(dá)譜：與健康對(duì)照相比,動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中異常表達(dá)的miRNA有35種,其中25種miRNA高表達(dá),10種miRNA低表達(dá)。2、miRNA芯片結(jié)果的驗(yàn)證：與健康對(duì)照相比,動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中miR-135b-5p和miR-499a-3p的表達(dá)水平分別提高了8.77倍和1.78倍。3、miR-135b-5p和miR-499a-3p抑制共同下游靶基因MEF2C的表達(dá)：與對(duì)照組相比,升高miR-135b-5p和miR-499a-3p水平后,MEF2C的蛋白水平分別下降了33.41%和20.48%,Luciferase實(shí)驗(yàn)熒光強(qiáng)度分別下降了45.67%和26.39%,而不影響MEF2C的mRNA水平。4. miR-135b-5p和miR-499a-3p促進(jìn)HUVEC和VSMC的增殖和遷移：與對(duì)照相比,升高miR-135b-5p和miR-499a-3p水平后,HUVEC和VSMC的增殖速率和遷移速率明顯增加。5、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊處低表達(dá)MEF2C:與周圍血管壁相比,MEF2C在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊處低表達(dá)。結(jié)論本課題揭示了動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中miRNA的表達(dá),其中異常高表達(dá)的miR-135b-5p和miR-499a-3p共同調(diào)控MEF2C的表達(dá),并通過MEF2C促進(jìn)HUVEC和VSMC的增殖和遷移。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R543.5

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1 許志亮;血清MiR-135b-5p和MiR-499a-3p在動(dòng)脈粥樣硬化中功能機(jī)制的初步研究[D];山東大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：1321260