本文關鍵詞：以RUNX3為靶點干預低氧誘導人心臟微血管內(nèi)皮細胞間質轉分化

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【摘要】：目的:1、研究低氧對人心臟微血管內(nèi)皮細胞(HCMECs)間質轉分化的影響;2、HCMECs間質轉分化過程中TGF-β信號通路及Notch信號通路的變化;3、RUNX3敲減對HCMECs的功能及間質轉分化的影響及具體機制。方法:1、研究低氧對HCMECs間質轉分化的影響。實驗分組Normoxia組:常氧(21%O2、5%CO2、74%N2,37℃)條件下培養(yǎng)HCMECs;Hypoxia組:低氧(1%O2、5%CO2、94%N2,37℃)培養(yǎng)HCMECs,兩組細胞分別于培養(yǎng)1天、4天、5天(用H1、H4、H5表示)。進行如下實驗:⑴光學顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)學變化;⑵免疫熒光雙標染色,在熒光顯微鏡下觀察CD31、αSMA強度變化及CD31+/αSMA+雙陽性細胞(代表正在發(fā)生間質轉分化的內(nèi)皮細胞),并計數(shù)分析;⑶RT-PCR法測定各組細胞中CD31、VE-cadherin、αSMA及FSP-1m RNA含量并比較。2、研究低氧誘導HCMECs間質轉分化過程中TGF-β及Notch信號通路的變化,RUNX3敲減對HCMECs的功能及間質轉分化的影響。實驗分組Control組:常氧條件下培養(yǎng)HCMECs。Hypoxia組:低氧條件下培養(yǎng)HCMECs 4天。RUNX3組:常氧條件下培養(yǎng)HCMECs,鋪板過夜后轉染RUNX3-RNAi慢病毒,低氧培養(yǎng)4天。GFP組:常氧條件下培養(yǎng)HCMECs,鋪板過夜后轉染空載體慢病毒,低氧培養(yǎng)4天。各組細胞進行如下實驗:⑴免疫熒光雙標染色,在熒光顯微鏡下觀察CD31、αSMA強度變化及CD31+/αSMA+雙陽性細胞(代表正在發(fā)生間質轉分化的內(nèi)皮細胞),并計數(shù)分析;⑵應用Transwell遷移實驗對各組HCMECs遷移能力進行檢測;⑶應用小管形成實驗對各組HCMECs血管新生能力進行檢測并比較;⑷RT-PCR法測定各組細胞中CD31、VE-Cadherin、αSMA、FSP-1、RUNX3、TGF-β1、Smad2、Smad3、Notch-1、Hes1、Hey1、Slug、Snail的m RNA含量并比較;⑸Western blot法測定各組細胞中CD31、VE-Cadherin、αSMA、FSP-1、RUNX3、Notch-1、Hes1、Hey1、Slug、Snail、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白含量并比較。結果:1、低氧對HCMECs間質轉分化的影響:⑴光學顯微鏡可見:與Normoxia組比較,Hypoxia組HCMECs細胞逐漸出現(xiàn)形態(tài)學變化,失去了鋪路石樣或鵝卵石樣結構,逐漸呈長梭形或紡錘形生長。⑵免疫雙標熒光染色結果顯示:隨著低氧時間延長,Hypoxia組HCMECs中CD31強度逐漸減弱,αSMA強度逐漸增強,其中H4組CD31+/αSMA+雙陽性細胞最多(P0.01)。⑶RT-PCR結果顯示:Hypoxia組HCMECs中CD31、VE-cadherin的m RNA表達降低,αSMA、FSP-1的m RNA表達升高(P0.05)。2、敲減RUNX3基因對HCMECs間質轉分化的影響:⑴免疫雙標熒光染色結果顯示:與GFP組相比,RUNX3組HCMECs中的CD31強度增強,αSMA強度減弱。⑵RT-PCR及Western Blot結果顯示:與Hypoxia組相比,RUNX3組細胞的CD31、VE-Cadherin的m RNA及蛋白表達上調(diào)而αSMA、FSP-1 m RNA及蛋白表達下調(diào)(P0.05)。3、敲減RUNX3基因對HCMECs功能的影響:⑴小管形成實驗結果顯示:低氧促進HCMECs血管成型,而RUNX3敲減后進一步促進血管成型(P0.05)。⑵Transwell遷移實驗結果顯示:低氧促進HCMECs遷移,RUNX3敲減后部分抑制了HCMECs遷移能力(P0.05)。4、HCMECs間質轉分化過程中TGF-β信號通路的變化:⑴RT-PCR結果顯示:低氧激活了TGF-β信號通路,Hypoxia組的TGF-β1、Smad2、Smad3的m RNA表達水平均增高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。RUNX3敲減后TGF-β1m RNA表達水平進一步增高,而Smad2、Smad3的m RNA表達水平均下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。⑵Western Blot檢測顯示:低氧促進Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表達(P0.05);RUNX3敲減后是Smad2/3、P-smad2/3蛋白表達均下調(diào)(P0.05),且p-Smad2/3下降比例更大(P0.05)。5、HCMECs間質轉分化過程中Notch信號通路的變化:RT-PCR及Western Blot檢測結果顯示:低氧同時激活了Notch信號通路,Hypoxia組的Notch-1、Slug、Snail、Hes1、Hey1 m RNA及蛋白的表達上調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。RUNX3敲減后Notch-1上調(diào)更明顯,內(nèi)皮間質轉分化主要轉錄因子Slug、Snail均不同程度下調(diào),同時Hes1、Hey1的表達水平明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:1、低氧能誘導HCMECs發(fā)生間質轉分化,同時促進血管新生及細胞遷移;2、TGF-β信號通路及Notch信號通路均上調(diào),提示兩信號通路在低氧誘導HCMECs間質轉分化過程中起重要作用;3、RUNX3低表達減輕低氧誘導HCMECs間質轉分化,RUNX3低表達部分抑制了TGF-β信號通路及Notch信號通路,RUNX3可能為TGF-β信號通路及Notch信號通路下游的共同靶點。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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本文編號：1293776