本文關(guān)鍵詞：AT4R過表達(dá)抑制動(dòng)脈粥樣硬化的作用及其機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是一類非常重要的心血管疾病。實(shí)驗(yàn)證實(shí)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)斑塊形成可導(dǎo)致管腔狹窄引發(fā)缺血,而斑塊破裂及血栓形成則可導(dǎo)致急性心腦血管事件的發(fā)生。因此,對(duì)于AS早期斑塊形成和晚期斑塊穩(wěn)定性的研究一直是國(guó)內(nèi)外冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病研究的熱點(diǎn)問題。腎素一血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在心血管系統(tǒng)疾病的病理生理中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。血管緊張素IV型受體(AT4R)是RAS系統(tǒng)中的一員,是一種II型膜蛋白并且屬于鋅金屬肽酶M1家族。同時(shí)AT4R被認(rèn)為是一種胰島素調(diào)節(jié)的氨基肽酶(IRAP)并可以通過結(jié)合血管緊張素IV (AngⅣ)發(fā)揮作用。在心內(nèi)膜、心外膜、血管平滑肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞、冠狀動(dòng)脈和主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞等心血管的組織和細(xì)胞中都有AT4R的存在。既往研究發(fā)現(xiàn)AT4R可以誘導(dǎo)激活肺內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性并且參與調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈的舒張。AT4R還可協(xié)同成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)參與血管重建。此外,研究還發(fā)現(xiàn)AT4R和Ang Ⅳ共同作用可以改善AngⅡ刺激以及缺血再灌注引起的心功能紊亂和損傷。在晚期AS模型中, Ang Ⅳ通過結(jié)合AT4R能夠改善內(nèi)皮功能,增加eNOS活性及降低超氧化物的產(chǎn)生,進(jìn)而發(fā)揮血管保護(hù)作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Ang Ⅳ可通過結(jié)合AT4R,在心血管系統(tǒng)疾病中起著保護(hù)作用,然而AT4R其本身在AS中發(fā)揮何種作用及其可能的作用機(jī)制尚未見報(bào)道,這為我們提供了課題思路和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方向。研究目的1.探討AT4R過表達(dá)對(duì)AS早期斑塊形成的影響；2.探討AT4R過表達(dá)對(duì)AS晚期斑塊穩(wěn)定性的影響；3.闡明AT4R過表達(dá)抗AS作用可能的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法1.構(gòu)建ApoE-/-小鼠AS動(dòng)物模型(1)早期組：8周齡雄性ApoE-/-小鼠普通飲食適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后給予高脂飲食(0.25%的膽固醇和15%的黃油)8周。高脂飲食至第4周將小鼠隨機(jī)分為Ad-AT4R組,Ad-EGFP組和Control組,每組20只。Ad-AT4R組和Ad-EGFP組分別通過尾靜脈注射攜帶有AT4R的腺病毒、空病毒載體,病毒滴度為2×109PFU,體積為200μL。 Control組同時(shí)注射等量的PBS溶液。2周后重復(fù)注射一次。繼續(xù)高脂飲食至第8周處死小鼠。(2)晚期組：8周齡雄性ApoE-/-小鼠全程高脂飲食14周。高脂飲食至第2周行右頸總動(dòng)脈套管植入術(shù),套管長(zhǎng)度為2mm,內(nèi)徑為0.3mm,外徑為0.5mmm。第10周行頸動(dòng)脈超聲檢查斑塊形成情況并將小鼠隨機(jī)分為三組：Ad-AT4R組，，Ad-EGFP組和Control組,每組20只,分別通過尾靜脈注射攜帶有AT4R的腺病毒、空病毒載體及等量的PBS溶液。病毒滴度為2×109PFU,體積為200μL。2周后重復(fù)注射一次。繼續(xù)高脂飲食至第14周處死小鼠。2.體重及血糖、血脂的檢測(cè)小鼠處死前禁食,稱量體重并于左心室穿刺取血,收集血清,檢測(cè)甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血糖(GLU)。3.早期斑塊面積的檢測(cè)取早期組小鼠的主動(dòng)脈根部包埋成石蠟標(biāo)本并常規(guī)5μm切片,HE染色。另取主動(dòng)脈根部沖洗,OCT包埋,常規(guī)5μm冰凍切片,油紅o染色,同時(shí)行主動(dòng)脈大體油紅o染色。使用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算陽(yáng)性染色面積占相應(yīng)主動(dòng)脈管腔的面積百分比。4.晚期斑塊的檢測(cè)(1)易損指數(shù)：OCT包埋晚期組小鼠的右頸總動(dòng)脈,常規(guī)5μm冰凍切片并行油紅O染色、HE染色及天狼猩紅染色。免疫組化檢測(cè)斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞(MOMA-2)以及平滑肌細(xì)胞(SMC)的含量。使用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算陽(yáng)性染色面積占AS斑塊面積的百分比。易損指數(shù)根據(jù)以下公式計(jì)算：易損指數(shù)=(巨噬細(xì)胞百分含量+脂質(zhì)百分含量)／(平滑肌細(xì)胞百分含量+膠原百分含量)。(2)免疫組化：采用免疫組化的方法檢測(cè)斑塊內(nèi)促炎性因子IL-6、TNF-a及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的表達(dá)。使用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算陽(yáng)性染色面積占AS斑塊面積的百分比。(3) Western Blot:提取晚期組小鼠右頸總動(dòng)脈的組織蛋白,并用Western Blot的方法檢測(cè)促炎性因子IL-6、TNF-a,基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9以及RAS系統(tǒng)其他組分比如AT1R、 T2R、MasR、ACE、ACE2的蛋白表達(dá)水平。使用ImageJ軟件分析蛋白表達(dá)含量。(4)明膠酶譜：提取晚期組小鼠右頸總動(dòng)脈的組織蛋白,采用明膠酶譜的方法檢測(cè)MMP-2及MMP-9的活性。使用Image J軟件分析。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean ±SEM)表示。組間差異采用單因素的方差分析(ANOVA). P0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.早期組1.1 AT4R過表達(dá)對(duì)ApoE-/-小鼠體重及血糖血脂的影響Ad-AT4R組、Ad-EGFP組和Control組三組之間小鼠的體重及血糖(GLU)、血脂指標(biāo)(TG、TC、HDL-C、LDL-C)之間未見顯著性差異(P0.05)。1.2 AT4R轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定小鼠肝臟和主動(dòng)脈根部斑塊可見明顯顆粒狀黃綠色熒光,提示病毒成功轉(zhuǎn)染至小鼠體內(nèi)；Western Blot檢測(cè)Ad-AT4R組小鼠主動(dòng)脈組織蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)AT4R表達(dá)量明顯高于Ad-EGFP組和Control組(P0.05),說明AT4R成功過表達(dá)。1.3 AT4R過表達(dá)對(duì)AS早期斑塊的形成的影響與Ad-EGFP組及Control組對(duì)比,Ad-AT4R組小鼠主動(dòng)脈根部AS斑塊面積百分比明顯降低(P0.05),而Ad-EGFP與Control組之間未見顯著性差異(P0.05)。2.晚期組2.1 AT4R過表達(dá)對(duì)ApoE-/-小鼠體重及血糖血脂的影響Ad-AT4R組、Ad-EGFP組和Control組三組之間小鼠的體重及血糖(GLU)、血脂指標(biāo)(TG、TC、HDL-C、LDL-C)之間未見顯著性差異(P0.05)。2.2 AT4R轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定小鼠右頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)可見明顯顆粒狀黃綠色熒光,提示病毒成功轉(zhuǎn)染至小鼠體內(nèi)；Western Blot檢測(cè)Ad-AT4R組小鼠主動(dòng)脈組織蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)AT4R表達(dá)量明顯高于Ad-EGFP組和Control組(P0.05),說明AT4R成功過表達(dá)。2.3 AT4R過表達(dá)對(duì)AS晚期斑塊的穩(wěn)定性的影響與Ad-EGFP組和Control組對(duì)比,Ad-AT4R組小鼠頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞及脂質(zhì)百分含量降低(P0.05),平滑肌細(xì)胞和膠原含量增加(P0.05),斑塊易損指數(shù)明顯降低(P0.05),而Ad-EGFP組與Control組之間未見顯著性差異(P0.05)。2.4AT4R過表達(dá)對(duì)晚期斑塊內(nèi)炎性因子IL-6、TNF-a的表達(dá)水平的影響與Ad-EGFP組及Control組對(duì)比,Ad-AT4R組小鼠頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)炎性因子IL-6、TNF-a蛋白表達(dá)下降(P0.05),Ad-EGFP組與Control組之間未見顯著性差異(P0.05)。2.5 AT4R過表達(dá)對(duì)晚期斑塊內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)和活性的影響與Ad-EGFP組及Control組對(duì)比,Ad-AT4R組小鼠頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)MMP-2、 MMP-9蛋白表達(dá)降低(P0.05),且MMP-2和MMP-9的活性降低(P0.05),Ad-EGFP組與Control組之間未見顯著性差異(P0.05)。2.6 AT4R過表達(dá)對(duì)晚期斑塊內(nèi)RAS其他組分的影響與Ad-EGFP組及Control組對(duì)比,Ad-AT4R組小鼠頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)RAS其它組分(AT1R, AT2R, MasR, ACE and ACE2)蛋白表達(dá)未見顯著性差異(P0.05)。結(jié)論1.AT4R過表達(dá)可通過降低斑塊內(nèi)脂質(zhì)從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化早期斑塊的形成；2.AT4R過表達(dá)可減少晚期斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞和脂質(zhì)含量,增加平滑肌細(xì)胞和膠原含量,從而降低斑塊易損指數(shù),增加斑塊穩(wěn)定性；3.AT4R過表達(dá)可降低斑塊內(nèi)IL-6、TNF-a的表達(dá),從而減輕炎癥、穩(wěn)定斑塊；4.AT4R過表達(dá)可降低MMP-2、MMP-9的表達(dá)及其活性,從而抑制ECM降解,穩(wěn)定斑塊；5.AT4R過表達(dá)對(duì)RAS系統(tǒng)其它成員(AT1R、AT2R、MasR、ACE、ACE2)的表達(dá)沒有影響。
【關(guān)鍵詞】：AT4R 動(dòng)脈粥樣硬化 早期斑塊形成 晚期斑塊穩(wěn)定性
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R543.5
【目錄】：

• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-18
• 符號(hào)說明18-20
• 前言20-21
• 材料與方法21-35
• 結(jié)果35-37
• 討論37-40
• 創(chuàng)新點(diǎn)與局限性40
• 結(jié)論40-41
• 附表41-42
• 附圖42-52
• 參考文獻(xiàn)52-57
• 致謝57-58
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄58-59
• 附件59

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本文編號(hào)：1026422