本文關鍵詞：AT4R過表達抑制動脈粥樣硬化的作用及其機制研究

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【摘要】：研究背景冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是一類非常重要的心血管疾病。實驗證實動脈粥樣硬化(AS)斑塊形成可導致管腔狹窄引發(fā)缺血,而斑塊破裂及血栓形成則可導致急性心腦血管事件的發(fā)生。因此,對于AS早期斑塊形成和晚期斑塊穩(wěn)定性的研究一直是國內外冠狀動脈粥樣硬化性心臟病研究的熱點問題。腎素一血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在心血管系統(tǒng)疾病的病理生理中發(fā)揮著至關重要的作用。血管緊張素IV型受體(AT4R)是RAS系統(tǒng)中的一員,是一種II型膜蛋白并且屬于鋅金屬肽酶M1家族。同時AT4R被認為是一種胰島素調節(jié)的氨基肽酶(IRAP)并可以通過結合血管緊張素IV (AngⅣ)發(fā)揮作用。在心內膜、心外膜、血管平滑肌細胞、心肌成纖維細胞、冠狀動脈和主動脈內皮細胞等心血管的組織和細胞中都有AT4R的存在。既往研究發(fā)現(xiàn)AT4R可以誘導激活肺內皮細胞內皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性并且參與調節(jié)肺動脈的舒張。AT4R還可協(xié)同成纖維細胞生長因子(bFGF)參與血管重建。此外,研究還發(fā)現(xiàn)AT4R和Ang Ⅳ共同作用可以改善AngⅡ刺激以及缺血再灌注引起的心功能紊亂和損傷。在晚期AS模型中, Ang Ⅳ通過結合AT4R能夠改善內皮功能,增加eNOS活性及降低超氧化物的產生,進而發(fā)揮血管保護作用。這些實驗結果提示Ang Ⅳ可通過結合AT4R,在心血管系統(tǒng)疾病中起著保護作用,然而AT4R其本身在AS中發(fā)揮何種作用及其可能的作用機制尚未見報道,這為我們提供了課題思路和實驗設計方向。研究目的1.探討AT4R過表達對AS早期斑塊形成的影響；2.探討AT4R過表達對AS晚期斑塊穩(wěn)定性的影響；3.闡明AT4R過表達抗AS作用可能的機制。實驗方法1.構建ApoE-/-小鼠AS動物模型(1)早期組：8周齡雄性ApoE-/-小鼠普通飲食適應性喂養(yǎng)3天后給予高脂飲食(0.25%的膽固醇和15%的黃油)8周。高脂飲食至第4周將小鼠隨機分為Ad-AT4R組,Ad-EGFP組和Control組,每組20只。Ad-AT4R組和Ad-EGFP組分別通過尾靜脈注射攜帶有AT4R的腺病毒、空病毒載體,病毒滴度為2×109PFU,體積為200μL。 Control組同時注射等量的PBS溶液。2周后重復注射一次。繼續(xù)高脂飲食至第8周處死小鼠。(2)晚期組：8周齡雄性ApoE-/-小鼠全程高脂飲食14周。高脂飲食至第2周行右頸總動脈套管植入術,套管長度為2mm,內徑為0.3mm,外徑為0.5mmm。第10周行頸動脈超聲檢查斑塊形成情況并將小鼠隨機分為三組：Ad-AT4R組，，Ad-EGFP組和Control組,每組20只,分別通過尾靜脈注射攜帶有AT4R的腺病毒、空病毒載體及等量的PBS溶液。病毒滴度為2×109PFU,體積為200μL。2周后重復注射一次。繼續(xù)高脂飲食至第14周處死小鼠。2.體重及血糖、血脂的檢測小鼠處死前禁食,稱量體重并于左心室穿刺取血,收集血清,檢測甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血糖(GLU)。3.早期斑塊面積的檢測取早期組小鼠的主動脈根部包埋成石蠟標本并常規(guī)5μm切片,HE染色。另取主動脈根部沖洗,OCT包埋,常規(guī)5μm冰凍切片,油紅o染色,同時行主動脈大體油紅o染色。使用Image-Pro Plus 6.0軟件計算陽性染色面積占相應主動脈管腔的面積百分比。4.晚期斑塊的檢測(1)易損指數(shù)：OCT包埋晚期組小鼠的右頸總動脈,常規(guī)5μm冰凍切片并行油紅O染色、HE染色及天狼猩紅染色。免疫組化檢測斑塊內巨噬細胞(MOMA-2)以及平滑肌細胞(SMC)的含量。使用Image-Pro Plus 6.0軟件計算陽性染色面積占AS斑塊面積的百分比。易損指數(shù)根據(jù)以下公式計算：易損指數(shù)=(巨噬細胞百分含量+脂質百分含量)／(平滑肌細胞百分含量+膠原百分含量)。(2)免疫組化：采用免疫組化的方法檢測斑塊內促炎性因子IL-6、TNF-a及基質金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的表達。使用Image-Pro Plus 6.0軟件計算陽性染色面積占AS斑塊面積的百分比。(3) Western Blot:提取晚期組小鼠右頸總動脈的組織蛋白,并用Western Blot的方法檢測促炎性因子IL-6、TNF-a,基質金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9以及RAS系統(tǒng)其他組分比如AT1R、 T2R、MasR、ACE、ACE2的蛋白表達水平。使用ImageJ軟件分析蛋白表達含量。(4)明膠酶譜：提取晚期組小鼠右頸總動脈的組織蛋白,采用明膠酶譜的方法檢測MMP-2及MMP-9的活性。使用Image J軟件分析。5.統(tǒng)計學處理使用SPSS20.0統(tǒng)計軟件分析。所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(mean ±SEM)表示。組間差異采用單因素的方差分析(ANOVA). P0.05具有統(tǒng)計學意義。結果1.早期組1.1 AT4R過表達對ApoE-/-小鼠體重及血糖血脂的影響Ad-AT4R組、Ad-EGFP組和Control組三組之間小鼠的體重及血糖(GLU)、血脂指標(TG、TC、HDL-C、LDL-C)之間未見顯著性差異(P0.05)。1.2 AT4R轉染效率的測定小鼠肝臟和主動脈根部斑塊可見明顯顆粒狀黃綠色熒光,提示病毒成功轉染至小鼠體內；Western Blot檢測Ad-AT4R組小鼠主動脈組織蛋白表達,發(fā)現(xiàn)AT4R表達量明顯高于Ad-EGFP組和Control組(P0.05),說明AT4R成功過表達。1.3 AT4R過表達對AS早期斑塊的形成的影響與Ad-EGFP組及Control組對比,Ad-AT4R組小鼠主動脈根部AS斑塊面積百分比明顯降低(P0.05),而Ad-EGFP與Control組之間未見顯著性差異(P0.05)。2.晚期組2.1 AT4R過表達對ApoE-/-小鼠體重及血糖血脂的影響Ad-AT4R組、Ad-EGFP組和Control組三組之間小鼠的體重及血糖(GLU)、血脂指標(TG、TC、HDL-C、LDL-C)之間未見顯著性差異(P0.05)。2.2 AT4R轉染效率的測定小鼠右頸動脈斑塊內可見明顯顆粒狀黃綠色熒光,提示病毒成功轉染至小鼠體內；Western Blot檢測Ad-AT4R組小鼠主動脈組織蛋白表達,發(fā)現(xiàn)AT4R表達量明顯高于Ad-EGFP組和Control組(P0.05),說明AT4R成功過表達。2.3 AT4R過表達對AS晚期斑塊的穩(wěn)定性的影響與Ad-EGFP組和Control組對比,Ad-AT4R組小鼠頸動脈斑塊內巨噬細胞及脂質百分含量降低(P0.05),平滑肌細胞和膠原含量增加(P0.05),斑塊易損指數(shù)明顯降低(P0.05),而Ad-EGFP組與Control組之間未見顯著性差異(P0.05)。2.4AT4R過表達對晚期斑塊內炎性因子IL-6、TNF-a的表達水平的影響與Ad-EGFP組及Control組對比,Ad-AT4R組小鼠頸動脈斑塊內炎性因子IL-6、TNF-a蛋白表達下降(P0.05),Ad-EGFP組與Control組之間未見顯著性差異(P0.05)。2.5 AT4R過表達對晚期斑塊內基質金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9蛋白表達和活性的影響與Ad-EGFP組及Control組對比,Ad-AT4R組小鼠頸動脈斑塊內MMP-2、 MMP-9蛋白表達降低(P0.05),且MMP-2和MMP-9的活性降低(P0.05),Ad-EGFP組與Control組之間未見顯著性差異(P0.05)。2.6 AT4R過表達對晚期斑塊內RAS其他組分的影響與Ad-EGFP組及Control組對比,Ad-AT4R組小鼠頸動脈斑塊內RAS其它組分(AT1R, AT2R, MasR, ACE and ACE2)蛋白表達未見顯著性差異(P0.05)。結論1.AT4R過表達可通過降低斑塊內脂質從而抑制動脈粥樣硬化早期斑塊的形成；2.AT4R過表達可減少晚期斑塊內巨噬細胞和脂質含量,增加平滑肌細胞和膠原含量,從而降低斑塊易損指數(shù),增加斑塊穩(wěn)定性；3.AT4R過表達可降低斑塊內IL-6、TNF-a的表達,從而減輕炎癥、穩(wěn)定斑塊；4.AT4R過表達可降低MMP-2、MMP-9的表達及其活性,從而抑制ECM降解,穩(wěn)定斑塊；5.AT4R過表達對RAS系統(tǒng)其它成員(AT1R、AT2R、MasR、ACE、ACE2)的表達沒有影響。
【關鍵詞】：AT4R 動脈粥樣硬化 早期斑塊形成 晚期斑塊穩(wěn)定性
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R543.5
【目錄】：

• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-18
• 符號說明18-20
• 前言20-21
• 材料與方法21-35
• 結果35-37
• 討論37-40
• 創(chuàng)新點與局限性40
• 結論40-41
• 附表41-42
• 附圖42-52
• 參考文獻52-57
• 致謝57-58
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄58-59
• 附件59

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