本文關(guān)鍵詞：血小板微泡對內(nèi)皮細(xì)胞作用及機(jī)制的體外研究

  更多相關(guān)文章： 微小RNA 內(nèi)皮細(xì)胞 血小板 微泡

【摘要】：一、研究背景微泡是細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)的一種載體,包含蛋白質(zhì)、mRNA、miRNAs等多種生物活性物質(zhì),在細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等病理生理過程中扮演重要角色。血小板是循環(huán)中微泡的主要來源,臨床研究顯示在冠心病、房顫等患者的循環(huán)中,微泡含量顯著增加,并且和多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。我們前期的研究顯示,凝血酶激活血小板后產(chǎn)生的微泡中miRNAs的表達(dá)譜顯著改變,并且可以被內(nèi)皮細(xì)胞吸收,在轉(zhuǎn)錄后途徑發(fā)揮作用。MiRNA是一種長度約為21-23個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子,通過特異性結(jié)合mRNA序列,誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化或者降解mRNA,調(diào)控基因的表達(dá)。隨著研究的進(jìn)展,miRNA在各種病理生理過程中的調(diào)節(jié)作用越來越受到重視,并有可能成為疾病診斷的標(biāo)志物和未來生物治療的靶點(diǎn)。二、研究目的(1)建立完善血小板來源微泡(PMP)的分離、提取及鑒定方法,并比較漩渦震蕩和凝血酶兩種刺激方式對微泡及其表面膜蛋白的影響;(2)研究凝血酶刺激產(chǎn)生的血小板微泡對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、遷移、活性氧(ROS)產(chǎn)生、一氧化氮(NO)及炎癥因子分泌的作用;(3)初步探索微泡對內(nèi)皮細(xì)胞中miRNAs表達(dá)的影響,及其中的miRNA對內(nèi)皮細(xì)胞上述表型的作用及機(jī)制。三、研究方法(1)使用凝血酶刺激和漩渦震蕩刺激血小板產(chǎn)生微泡,使用梯度離心法收集血小板來源的微泡,利用流式細(xì)胞儀分析微泡的大小、數(shù)量及表面的膜蛋白,透射電鏡分析微泡的內(nèi)在結(jié)構(gòu)。(2)應(yīng)用H2O2誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,應(yīng)用AnnexinVFITC/PI雙染檢測凝血酶刺激所得微泡對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響;平板劃痕和Transwel l評價(jià)微泡對內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響;Elisa法確定微泡對內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎癥因子的影響;Griess法測定微泡對內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO的影響;ROS試劑盒結(jié)合Image J軟件檢測微泡對內(nèi)皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生的作用。(3)實(shí)時(shí)定量PCR測定微泡對內(nèi)皮細(xì)胞microRNAs表達(dá)譜的改變作用。挑選其中改變最明顯的microRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染,并測定其對內(nèi)皮細(xì)胞上述各種表型的影響。應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證可能相對應(yīng)的靶基因。四、研究結(jié)果(1)流式細(xì)胞儀鑒定顯示,阿司匹林可以有效抑制血小板微泡的產(chǎn)生,凝血酶和漩渦震蕩刺激血小板均可產(chǎn)生大量微泡。通過凝血酶刺激和漩渦震蕩刺激并用梯度離心法可以提取純度較高的血小板微泡。微泡膜表面的具有復(fù)雜的蛋白成分,表達(dá)多種來源于血小板的膜蛋白。漩渦震蕩和凝血酶刺激獲得的微泡表面CD63表達(dá)差異明顯(55.38±5.27%vs 43.50±3.86%,p0.05)。透射電鏡顯示微泡內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣,電子密度不一,包含α顆粒、糖原顆粒、線粒體等復(fù)雜成分。(2)凝血酶刺激所得血小板微泡可以促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(25.59±9.50%vs 12.42±1.23%,p0.05)、細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生(0.140±0.010/pixel vs 0.109±0.010/pixel,p0.05)及IL-1β的分泌(2.67±0.87 pg/ml vs 1.25±0.41 pg/ml,p0.05),抑制其遷移(平板劃痕:47.99±4.65%vs 61.68±2.80%,p0.05;Transwell:123±15 vs 206±14,p0.01)和NO的分泌(27.68±1.70μmol/L vs 34.13±1.47μmol/L,p0.01)。(3)微泡處理內(nèi)皮細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)miR-223(150.60±29.63 vs 1.00±0.75,p0.001)、miR-320(20.84±18.58 vs 1.07±0.98,p0.05)顯著升高。腺病毒轉(zhuǎn)染miR-223后促進(jìn)了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(22.45±2.34%vs 12.95±0.36%,p0.001)、抑制了其遷移(平板劃痕:66.66±4.21%vs 71.59±4.02%,p0.05;Transwel l:151±17 vs 215±29,p0.05),但對細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生、炎癥因子及NO的分泌無明顯影響。Targetscan軟件及文獻(xiàn)回顧預(yù)測NRF1、ATP7A、ZEB1三種miR-223的靶基因。在mRNA水平上,miR-223對內(nèi)皮細(xì)胞中NRF1、ATP7A、ZEB1的表達(dá)并無顯著作用。雙熒光素酶報(bào)告基因顯示,miR-223對NRF1 3’UTR串聯(lián)的報(bào)告基因活性無明顯抑制,結(jié)合位點(diǎn)突變后報(bào)告基因活性無明顯增強(qiáng)。五、結(jié)論(1)血小板極易激活并產(chǎn)生大量表達(dá)血小板表面膜蛋白成分、大小結(jié)構(gòu)不一、內(nèi)容物復(fù)雜的微泡;通過梯度離心法可以提取純度較高的血小板微泡;凝血酶刺激所得微泡表面CD63較漩渦震蕩刺激所得微泡表面明顯降低。(2)血小板微泡促進(jìn)了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、ROS的產(chǎn)生、炎癥因子的分泌,抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和NO分泌。(3)血小板微泡傳遞大量miR-223至內(nèi)皮細(xì)胞中,并且可以通過miR-223促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,抑制其遷移。NRF1不是miR-223的靶基因。
【關(guān)鍵詞】：微小RNA 內(nèi)皮細(xì)胞 血小板 微泡
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R543.5
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 英文縮寫詞表11-12
• 前言12-14
• 第一部分 血小板微泡的提取及鑒定14-23
• 一、引言14
• 二、實(shí)驗(yàn)器材與方法14-17
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果17-21
• 四、討論21-23
• 第二部分 血小板微泡對內(nèi)皮細(xì)胞的作用23-37
• 一、引言23
• 二、實(shí)驗(yàn)器材與方法23-29
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-34
• 四、討論34-37
• 第三部分miR-223 對內(nèi)皮細(xì)胞的作用及機(jī)制的探索37-53
• 一、引言37-38
• 二、實(shí)驗(yàn)器材與方法38-43
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-50
• 四、討論50-53
• 全文總結(jié)53-54
• 附表54-55
• 文獻(xiàn)綜述55-62
• 參考文獻(xiàn)62-75
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明75-76
• 致謝76

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 游向東,周穎,單江,劉伊麗;蛋白微泡聲學(xué)造影劑在缺血再灌注心肌中排空現(xiàn)象及其機(jī)制的探討[J];中華超聲影像學(xué)雜志;2003年06期

2 李彬,萬明習(xí),王素品;納米包膜造影微泡在脈沖超聲場中的瞬態(tài)非線性特性研究[J];聲學(xué)學(xué)報(bào);2004年06期

3 張群霞,王志剛,冉海濤,李曉東,鄭元義,景香香;不同超聲強(qiáng)度及微泡對基因和組織作用的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華超聲影像學(xué)雜志;2005年04期

4 張虎,王宏宇;微泡和超聲 從診斷到治療[J];中國民康醫(yī)學(xué);2005年08期

5 魏倕;謝志行;;帶球殼微泡和空化氣泡的超聲特性研究[J];聲學(xué)技術(shù);2007年03期

6 楊莉;劉政;左松;譚開彬;高云華;付赤學(xué);李秋穎;;脂膜微泡結(jié)合凝血酶原復(fù)合物的制備[J];中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志;2007年05期

7 劉學(xué)兵;王志剛;許川山;夏新蜀;張勇;李攀;冉海濤;譚勇;;一種新型載光敏劑的微泡制備及其基本物理特性研究[J];激光雜志;2008年05期

8 朱蔚;周翔;羅燕;彭玉蘭;田野;王冬梅;柳曉軍;李珂;莊華;解慧琪;;“流動(dòng)的肺泡?”——超聲諧振微泡定向增加組織局部供氧的理論研究[J];中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù);2012年10期

9 李彬,萬明習(xí);納米包膜造影微泡的小波檢測技術(shù)研究[J];聲學(xué)學(xué)報(bào);2005年05期

10 徐亞麗;高云華;劉政;譚開彬;付赤學(xué);;微泡超聲爆破助溶血栓機(jī)制的離體研究[J];中華超聲影像學(xué)雜志;2006年04期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 柳建華;蕭淑宜;何景光;區(qū)文財(cái);邱春花;馮桂英;;微泡聯(lián)合低強(qiáng)度治療超聲對犬睪丸組織及細(xì)胞影響的研究[A];中國超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第九屆全國腹部超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2012年

2 張群霞;王志剛;冉海濤;李曉東;鄭元義;景香香;;不同超聲強(qiáng)度及微泡對基因和組織作用的實(shí)驗(yàn)研究[A];第九屆全國超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

3 姜學(xué)平;程茜;錢夢，

本文編號(hào)：1015932