發(fā)布時(shí)間：2017-10-06 21:26

  本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌物IL-10對(duì)肝星形細(xì)胞的抑制與凋亡作用研究

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【摘要】：肝臟疾病是一種世界性的疾病,如不能得到有效的防護(hù)和治療,往往會(huì)進(jìn)一步惡化,最終發(fā)展為肝硬化或肝癌。肝臟疾病惡化是一個(gè)漫長而又復(fù)雜的過程,在這一過程中肝臟比較明顯的病理變化就是肝纖維化。肝纖維化是由肝組織過度修復(fù)再生導(dǎo)致的一種肝臟病理病變,在此過程中肝星形細(xì)胞(Hepatic Stellate Cells,HSCs)被激活,同時(shí)肝臟細(xì)胞外基質(zhì)合成增多,降解減少,最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積。目前研究表明,肝纖維化是一個(gè)可逆的過程,抑制肝星形細(xì)胞的活化或者促進(jìn)其凋亡可以有效逆轉(zhuǎn)肝纖維化。因此,以HSCs為靶點(diǎn)的相關(guān)研究對(duì)肝臟疾病的治療具有重要意義。干細(xì)胞技術(shù)是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究比較前言的技術(shù)之一,干細(xì)胞治療方法也為多種疾病提供了新思路。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)因其具有取材方便、易于培養(yǎng)、穩(wěn)定性好和毒副作用小等特點(diǎn),被廣泛的用于多種疾病的治療研究,并呈現(xiàn)出較好的臨床治療效果。在肝臟疾病治療方面,BMSCs也具有較好的研究基礎(chǔ),但是具體的機(jī)理尚不明確。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子,白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)是一種重要的抗炎癥細(xì)胞因子,具有強(qiáng)大的抑制炎癥和巨噬細(xì)胞的功能,它主要由Th2細(xì)胞分泌,有文獻(xiàn)報(bào)道,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞也能分泌大量的白細(xì)胞介素-10。但是,BMSCs是否通過IL-10來發(fā)揮對(duì)肝損傷的治療作用尚不明確。所以,本課題將對(duì)這一科學(xué)問題進(jìn)行探索分析。本課題采用非灌流法從大鼠體內(nèi)提取肝星形細(xì)胞,通過細(xì)胞形態(tài)觀察,油紅O染色及蘇木素染色和免疫組化對(duì)分離培養(yǎng)的HSCs進(jìn)行鑒定。采用密度梯度離心法從大鼠股骨和脛骨分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,通過細(xì)胞形態(tài)觀察、免疫組化鑒定分離培養(yǎng)的BMSCs,通過成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)確定BMSCs的多能性。收集第3代BMSCs培養(yǎng)液上清,利用Elisa法檢測BMSCs培養(yǎng)液上清中IL-10濃度,并將上清直接作用于HSCs 24h、48h和72h,分析上清對(duì)HSCs增殖和凋亡的影響。進(jìn)一步通過Transwell共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)確定BMSCs分泌物IL-10對(duì)HSCs的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:分離培養(yǎng)的HSCs呈現(xiàn)明顯的星形細(xì)胞形態(tài),油紅O染色呈陽性,并且能夠表達(dá)HSCs特異性蛋白Desmin、α-SMA和GFAP。分離培養(yǎng)的BMSCs能夠表達(dá)特異性的標(biāo)記物CD29、CD44和CD45,并且具有較好的成脂和成骨分化能力。Elisa檢測BMSCs培養(yǎng)液上清證明其具有分泌IL-10的功能,將上清直接作用于HSCs,在24h、48h和72h后均表現(xiàn)出對(duì)HSCs的增殖抑制效果及促進(jìn)凋亡的作用。Transwell實(shí)驗(yàn)表明BMSCs分泌的IL-10能夠有效的抑制HSCs中TGF-β1的分泌和α-SMA的表達(dá),同時(shí)促進(jìn)HSCs中凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)。綜上所述,本課題研究表明:BMSCs培養(yǎng)液上清具有抑制HSCs增殖并促進(jìn)其凋亡的作用,進(jìn)一步的研究表明上清中的IL-10對(duì)HSCs的增殖和凋亡起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。因此,本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為BMSCs是通過IL-10實(shí)現(xiàn)減輕和逆轉(zhuǎn)肝纖維化,為肝纖維化的臨床治療提供新的理論支持。
【關(guān)鍵詞】：白細(xì)胞介素-10 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 肝星形細(xì)胞 肝纖維化
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R575
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 中英文對(duì)照12-13
• 第1章 緒論13-21
• 1.1 肝臟疾病13-15
• 1.1.1 肝損傷及其治療13-14
• 1.1.2 肝纖維化與肝星形細(xì)胞研究進(jìn)展14-15
• 1.2 干細(xì)胞與干細(xì)胞治療15-18
• 1.2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞16-17
• 1.2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝纖維化的途徑17-18
• 1.3 白細(xì)胞介素-1018-21
• 1.3.1 白細(xì)胞介素-10 的主要功能18
• 1.3.2 白細(xì)胞介素-10 抗肝纖維化作用機(jī)制18-21
• 第2章 材料與試劑21-25
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物21
• 2.2 儀器21-22
• 2.3 試劑22-23
• 2.4 主要試劑的配方23-25
• 2.4.1 磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制23
• 2.4.2 10×TBS、1×TBST的配制23
• 2.4.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制23
• 2.4.4 成脂培養(yǎng)基23-24
• 2.4.5 成骨培養(yǎng)基24
• 2.4.6 1L 0.25%胰酶-EDTA配制24-25
• 第3章 實(shí)驗(yàn)方法25-32
• 3.1 BMSCs的分離培養(yǎng)和鑒定25-26
• 3.1.1 密度梯度離心法分離BMSCs25
• 3.1.2 BMSCs的培養(yǎng)25
• 3.1.3 BMSCs的鑒定25-26
• 3.1.3.1 免疫組化檢測BMSCs特異性表型25-26
• 3.1.3.2 BMSCs的成骨成脂誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)26
• 3.2 HSCs的分離培養(yǎng)與鑒定26-28
• 3.2.1 非灌流法提取HSCs26-27
• 3.2.2 HSCs的鑒定27-28
• 3.2.2.1 免疫組化檢測大鼠HSCs的特異性蛋白27-28
• 3.2.2.2 大鼠HSCs的油紅O染色及蘇木素染色28
• 3.3 BMSCs上清對(duì)HSCs的影響28-29
• 3.3.1 第3代BMSCs生長曲線的繪制28
• 3.3.2 第3代BMSCs培養(yǎng)上清的收集28
• 3.3.3 第3代BMSCs培養(yǎng)上清中IL-10 濃度檢測28-29
• 3.3.4 BMSCs上清作用于HSCs實(shí)驗(yàn)29
• 3.4 BMSCs與HSCs Transwell共培養(yǎng)29-31
• 3.4.1 實(shí)驗(yàn)分組29
• 3.4.2 細(xì)胞上清收集和細(xì)胞形態(tài)觀察29-30
• 3.4.3 HSCs上清中IL-10 和TGF-β1 的濃度檢測30
• 3.4.4 Western blot檢測HSCs中caspase-3 和α-SMA蛋白的表達(dá)30-31
• 3.4.4.1 HSCs細(xì)胞全蛋白的提取30
• 3.4.4.2 蛋白定量30
• 3.4.4.3 SDS-PAGE電泳30-31
• 3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)31-32
• 第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-46
• 4.1 BMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定32-34
• 4.2 HSCs的分離培養(yǎng)與鑒定34-37
• 4.2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察34
• 4.2.2 HSCs的油紅O染色結(jié)果34-35
• 4.2.3 免疫組化檢測HSCs特異性蛋白的表達(dá)結(jié)果35-36
• 4.2.4 HSCs第 2、5 代細(xì)胞GFAP免疫組化結(jié)果36-37
• 4.3 BMSCs上清對(duì)HSCs的作用37-40
• 4.3.1 第3代BMSCs生長曲線的繪制37-38
• 4.3.2 第3代BMSCs上清中IL-10 濃度的檢測38
• 4.3.3 BMSCs上清作用后HSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化38-39
• 4.3.4 BMSCs上清作用后HSCs生長曲線的變化39-40
• 4.4 BMSCs與HSCs Transwell共培養(yǎng)結(jié)果40-46
• 4.4.1 HSCs的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化40-41
• 4.4.2 Elisa檢測HSCs上清中IL-10 和TGF-β1 的濃度41-43
• 4.4.3 共培養(yǎng)后HSCsα-SMA和caspase-3 蛋白的表達(dá)情況43-46
• 第5章 結(jié)論46-47
• 第6章 討論47-51
• 參考文獻(xiàn)51-58
• 作者簡介58-59
• 致謝59

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：985110