本文關(guān)鍵詞：SIRT1在小鼠肝纖維化中的作用及其相關(guān)分子的組學(xué)研究

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【摘要】：目的:1.建立SIRT1肝臟特異性敲除(liver-specific knockout of SIRT1,SIRT1-LKO)小鼠模型;2.觀察SIRT1-LKO及其同窩野生型(wild type,WT)小鼠在四氯化碳(carbon tetrachloride,CCL4)誘導(dǎo)下的肝纖維化情況;3.篩選肝纖維化中與SIRT1相關(guān)的差異分子,系統(tǒng)地探討他們?cè)诟卫w維化中可能的作用;4.觀察白藜蘆醇(resveratrol,RES)對(duì)小鼠肝纖維化的保護(hù)作用。方法:1.利用Cre-Lox P重組酶系統(tǒng)構(gòu)建SIRT1-LKO小鼠模型,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定小鼠基因型,實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)驗(yàn)證小鼠肝組織中SIRT1基因表達(dá)水平,Western Blot和免疫組織化學(xué)驗(yàn)證SIRT1蛋白表達(dá)水平。2.經(jīng)腹腔注射CCL4橄欖油溶液來(lái)誘導(dǎo)小鼠肝纖維化,通過(guò)血清生化檢測(cè)肝功能,使用Sirius red染色觀察肝臟中的膠原纖維,免疫組織化學(xué)和Western Blot檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)的表達(dá)來(lái)觀察肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)活化。3.利用基因芯片技術(shù)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技術(shù),檢測(cè)SIRT1-LKO小鼠和WT小鼠在CCL4和橄欖油兩種不同處理因素下的基因和蛋白表達(dá)水平,依據(jù)纖維化造模結(jié)果制定篩選原則,篩選差異分子,采用DAVID Bioinformatics Resources 6.7系統(tǒng)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)合蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)鎖定候選分子并進(jìn)行Q-PCR驗(yàn)證。4.經(jīng)腹腔注射CCL4橄欖油溶液來(lái)誘導(dǎo)小鼠肝纖維化,同時(shí)腹腔注射白藜蘆醇二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)溶液,通過(guò)血清生化檢測(cè)肝功能,采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察肝組織形態(tài),Masson三色染色觀察肝臟膠原纖維。結(jié)果:1.通過(guò)對(duì)小鼠繁育、雜交和鑒定,我們成功建立了SIRT1-LKO小鼠模型,并獲得了其同窩對(duì)照WT小鼠。2.造模8周后,腹腔注射20%CCL4橄欖油溶液的SIRT1-LKO小鼠和WT小鼠的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase,AST)水平較單純注射橄欖油組顯著升高(P0.01),肝臟中膠原纖維增加,α-SMA蛋白表達(dá)水平升高;更為重要的是,我們首次發(fā)現(xiàn)同在CCL4誘導(dǎo)下,SIRT1-LKO小鼠較同窩WT小鼠的肝損傷和肝纖維化程度更加嚴(yán)重(P0.05)。3.通過(guò)對(duì)差異分子(倍數(shù)差異2)進(jìn)行篩選和生物信息學(xué)分析,從m RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)了一組SIRT1參與肝纖維化的相關(guān)分子,并對(duì)其中8個(gè)候選分子(AFP、OIP5、CCNB2、FHL2、GPC3、POC1A、CCNB1和PHGDH)進(jìn)行了Q-PCR驗(yàn)證,結(jié)果與基因芯片基本一致。4.造模8周后,CCL4組小鼠的血清ALT和AST水平較橄欖油組顯著升高(P0.01),肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷,肝臟中膠原纖維增加,而同時(shí)注射白藜蘆醇DMSO溶液的小鼠肝損傷和纖維化程度明顯減輕(P0.05)。結(jié)論:1.SIRT1-LKO增加CCL4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷,加重肝纖維化;2.SIRT1可能與上述候選分子協(xié)同參與了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展;3.白藜蘆醇對(duì)CCL4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷和肝纖維化具有明顯的保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：SIRT1 肝纖維化 生物信息學(xué) 白藜蘆醇
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R575.2
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表6-8
• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 前言12-14
• 文獻(xiàn)回顧14-23
• 1 肝纖維化14-18
• 1.1 肝纖維化的形成14-16
• 1.2 肝纖維化的逆轉(zhuǎn)16-17
• 1.3 肝纖維化、NAFLD與SIRT117-18
• 2 SIRT118-23
• 2.1 SIRT1的結(jié)構(gòu)和分布18-19
• 2.2 SIRT1的功能19-23
• 第一部分 SIRT1-LKO小鼠模型的建立23-38
• 1 材料23-27
• 1.1 小鼠品系23
• 1.2 主要試劑及藥物23-25
• 1.3 主要儀器及器材25-26
• 1.4 溶液的配制26-27
• 2 方法27-35
• 2.1 小鼠的飼養(yǎng)和繁殖27-28
• 2.2 小鼠基因型鑒定28-29
• 2.3 Q-PCR29-30
• 2.4 Western Blot30-33
• 2.5 免疫組織化學(xué)33-35
• 2.6 數(shù)據(jù)處理35
• 3 結(jié)果35-37
• 3.1 基因型鑒定結(jié)果35
• 3.2 Q-PCR結(jié)果35-36
• 3.3 Western Blot結(jié)果36
• 3.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果36-37
• 4 討論37-38
• 第二部分 SIRT1缺失加重CCL4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化38-45
• 1 材料38-40
• 1.1 小鼠品系38
• 1.2 主要試劑及藥物38-39
• 1.3 主要儀器及器材39-40
• 1.4 溶液的配制40
• 2 方法40-41
• 2.1 小鼠分組40
• 2.2 肝纖維化模型的建立40
• 2.3 樣本采集及送檢40-41
• 3 結(jié)果41-44
• 3.1 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果41-42
• 3.2 Sirius red染色結(jié)果42
• 3.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果42-43
• 3.4 Western Blot結(jié)果43-44
• 4 討論44-45
• 第三部分 篩選CCL4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化中SIRT1相關(guān)差異分子45-59
• 1 材料45-46
• 1.1 小鼠品系45
• 1.2 主要試劑及藥物45
• 1.3 主要儀器及器材45-46
• 2 方法46-50
• 2.1 小鼠肝臟組織的總RNA提取46
• 2.2 基因芯片檢測(cè)及差異基因篩選46-48
• 2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)分析及差異蛋白篩選48-49
• 2.4 生物信息學(xué)分析49-50
• 2.5 差異基因驗(yàn)證50
• 3 結(jié)果50-56
• 3.1 RNA和芯片質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果50-51
• 3.2 芯片質(zhì)控情況51
• 3.3 基因芯片數(shù)據(jù)篩選及生物信息學(xué)分析51-52
• 3.4 篩選候選分子52-54
• 3.5 Q-PCR驗(yàn)證結(jié)果54-56
• 3.6 蛋白定量結(jié)果56
• 3.7 差異蛋白篩選結(jié)果56
• 4 討論56-59
• 第四部分 白藜蘆醇減輕CCL4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化59-65
• 1 材料59-60
• 1.1 小鼠品系59
• 1.2 主要試劑及藥物59
• 1.3 主要儀器及器材59-60
• 1.4 溶液的配制60
• 2 方法60-62
• 2.1 小鼠分組60-61
• 2.2 肝纖維化模型的建立61
• 2.3 樣本采集及送檢61-62
• 3 結(jié)果62-63
• 3.1 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果62
• 3.2 HE染色結(jié)果62-63
• 3.3 Masson三色染色結(jié)果63
• 4 討論63-65
• 小結(jié)65-66
• 參考文獻(xiàn)66-76
• 附錄76-86
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果86-87
• 致謝87

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 陳立波,楊鎮(zhèn),裘法祖;Studies on Hepatocyte Apoptosis, Proliferation and Oncogene c-fos Expression in Carbon Tetrachloride-induced Cirrhotic Rat Liver[J];Journal of Tongji Medical University;1999年01期

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本文編號(hào)：973251