本文關(guān)鍵詞：降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌對大鼠非酒精性脂肪肝形成的影響及相關(guān)機(jī)制研究

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【摘要】：隨著肥胖、高脂血癥、2型糖尿病和代謝綜合征等疾病在全世界范圍的流行,非酒精性脂肪性肝(NAFLD)的發(fā)病率也不斷上升。近期研究表明,經(jīng)過4~13年后大約50%的NAFLD患者發(fā)展為非酒精性脂肪肝炎(NASH),40%的發(fā)展為肝纖維化。NAFLD的病理生理過程極為復(fù)雜,其發(fā)病機(jī)制仍不明確,并且目前沒有有效的治療方法,NASH的預(yù)后也不容樂觀。因此,非常有必要對非酒精性脂肪肝患者制定有效的干預(yù)措施。NAFLD患者常伴有肥胖、胰島素抵抗,但并不是所有的肥胖者都可以發(fā)展為NAFLD,腸道因素在NAFLD的致病機(jī)制中發(fā)揮了很大作用。研究顯示,腸道內(nèi)的革蘭氏陰性菌產(chǎn)生腸源性內(nèi)毒素(LPS),它們經(jīng)門靜脈輸送到肝臟,當(dāng)腸道菌群失衡時(shí),大量的革蘭氏陰性菌增殖并產(chǎn)生內(nèi)毒素,就會導(dǎo)致患者發(fā)生代謝紊亂,肥胖,糖尿病,NAFLD以及NASH。在對急性肝損傷小鼠模型研究發(fā)現(xiàn),小鼠腸粘膜通透性增強(qiáng)和細(xì)菌移位,并出現(xiàn)腸道菌群的改變。此外,在對NAFLD患者以及動物模型的研究中同樣發(fā)現(xiàn),其循環(huán)內(nèi)毒素水平都明顯高于正常水平,還存在著小腸細(xì)菌過度生長,腸粘膜通透性增加的現(xiàn)象。由于腸道菌群和肥胖、胰島素抵抗、NAFLD密切相關(guān),所以通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)有可能起到防治NAFLD的作用。益生菌和中藥均可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群改善NAFLD。已經(jīng)有研究顯示,益生菌具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡和降低機(jī)體膽固醇水平的作用,許多益生菌被制作成酸奶供高脂血癥和NAFLD患者食用。此外,決明子作為一種具有抑制脂肪積累的天然功能性食品添加劑,在改善肥胖,胰島素抵抗等代謝疾病中取得了良好的效果,這為NAFLD的治療提供了新的方向。決明子是豆科一年生草本植物,廣泛種植于熱帶亞洲國家,其主要有效成分為蒽醌類化合物,包括:決明素、大黃素、蘆薈大黃素等。它的草本成分被作為一種功能性飲料在該地區(qū)流行,并且具有降血脂,降膽固醇,抗氧化,抗真菌,保護(hù)神經(jīng)功能等生理效應(yīng)。決明子不僅對急性肝損傷大鼠肝功能有保護(hù)作用,而且可以通過上調(diào)AMP依賴的蛋白激酶,從而改善肥胖、胰島素抵抗以及NAFLD。雖然,益生菌和決明子均具有改善肥胖、胰島素抵抗、NAFLD等代謝疾病的效果,但是益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌是否可以提高NAFLD的防治效果仍不明確。綜上所述,我們假設(shè)益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌可以更好的改善NAFLD,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)以及肝臟的能量代謝有關(guān)。為了驗(yàn)證上述假設(shè),我們擬通過體外篩選和鑒定具有明確降脂效果的益生菌菌株,并與決明子蒽醌進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng),驗(yàn)證其降脂效率的變化。再將篩選出的降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌對高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠進(jìn)行干預(yù),并驗(yàn)證干預(yù)效果。第一部分降脂益生菌的體外篩選及生物學(xué)特性研究目的:前期我們使用硫酸鐵銨法,從健康人體以及傳統(tǒng)發(fā)酵食物中,篩選出了具有高效降膽固醇的菌株(體外降膽固醇效率50%)。在此基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步評估其降甘油三酯的能力,以及耐酸、耐膽鹽、耐胃蛋白酶、耐胰蛋白酶、細(xì)胞黏附性等生物學(xué)特性,并聯(lián)合決明子總蒽醌共培養(yǎng),了解其降脂效率的變化,選出最優(yōu)菌株為下一步實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。材料與方法:1.降膽固醇菌株與決明子總蒽醌聯(lián)合培養(yǎng),在MRS膽固醇培養(yǎng)基中,使用硫酸鐵銨法對其降膽固醇效率進(jìn)行檢測,并比較前后降膽固醇效率的變化。2.在MRS甘油三酯培養(yǎng)基中,對降膽固醇菌株以及其和決明子總蒽醌聯(lián)合培養(yǎng)的降脂效率進(jìn)行檢測,并比較降甘油三酯效率的變化。3.對菌株進(jìn)行耐受胃酸、耐受膽鹽、耐受胃蛋白酶、耐受胰蛋白酶、細(xì)胞黏附性實(shí)驗(yàn),評估其生物學(xué)特性。4.將篩選出的最優(yōu)菌株進(jìn)行質(zhì)粒檢測,并提取DNA進(jìn)行菌種鑒定。結(jié)果:1.降膽固醇菌株聯(lián)合決明子總蒽醌聯(lián)合培養(yǎng)后,降膽固醇效率均有所提升,其中以DM9054、DM9073、86066前后降解效率提高最為顯著(P0.05)。2.降膽固醇菌株聯(lián)合決明子總蒽醌聯(lián)合培養(yǎng)后,菌株8503、84034、86066降甘油三酯提高最為顯著(P0.05)。3.菌株DM9054和86066具有較好的耐胃酸能力,菌株DM9007、DM9054、86066有較好的耐膽鹽能力,DM9054和86066有較好的胃蛋白酶耐受能力,各個(gè)菌株對胰蛋白酶均有很好耐受力;相對于其他菌株,菌株DM9007、DM9054、86066細(xì)胞黏附性最強(qiáng)(P0.05)。4.最優(yōu)菌株為DM9054、86066,檢測無質(zhì)粒存在,經(jīng)過16Sr DNA測序比對,DM9054為鼠李糖乳桿菌、86066為植物乳桿菌。結(jié)論:DM9054為鼠李糖乳桿菌、86066為植物乳桿菌,均為益生菌,并且其聯(lián)合決明子總蒽醌培養(yǎng)可以提高降解膽固醇和甘油三酯的效率,起到協(xié)同作用。同時(shí),菌株具有較好的耐受消化液以及對腸上皮細(xì)胞的黏附能力,并不帶有質(zhì)粒。第二部分降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌對非酒精性脂肪肝大鼠脂代謝及相關(guān)基因表達(dá)的影響目的:通過篩選出的降脂益生菌DM9054、86066,并聯(lián)合具有協(xié)同降脂作用的決明子總蒽醌,共同干預(yù)NAFLD大鼠,分析其對脂代謝過程中相關(guān)基因和蛋白表達(dá)情況,以期發(fā)現(xiàn)降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌可能在脂代謝通路中的作用靶點(diǎn),進(jìn)一步探討其改善NAFLD的機(jī)制。材料與方法:1.SD大鼠隨機(jī)分為5組,分別給予正常飲食(ND),高脂飲食(HFD),高脂飲食+決明子總蒽醌0.2g/kg(HFD+AC),高脂飲食+高效降膽固醇益生菌2×1010 CFU/m L(HFD+P),高脂飲食+決明子總蒽醌+益生菌(HFD+TAC+P),所有分組大鼠連續(xù)干預(yù)150天后處死。2.評估各組大鼠一般情況,以及體重、Lee's指數(shù)及肝指數(shù)變化。3.檢測各組大鼠血脂水平、胰島素抵抗情況,評估血清內(nèi)毒素和肝臟TNF-α水平,并通過HE和油紅O染色觀察各組大鼠肝臟病理學(xué)改變。4.檢測大鼠肝臟CYP7A1、HMGCR、LDLR m RNA表達(dá)水平,以及腸道FXR m RNA表達(dá)水平,Western-Bloting檢測肝臟PPAR-α、PPAR-γ、SREBP-1c蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1.連續(xù)150天高脂飲食誘導(dǎo),成功建立了非酒精性脂肪肝大鼠模型。2.各組大鼠生命體征平穩(wěn),高脂飲食組大鼠體重、Lee's指數(shù)及肝指數(shù)較其余各組顯著增加(P0.05),通過降脂益生菌、決明子總蒽醌以及其聯(lián)合應(yīng)用,均可以顯著降低大鼠體重、Lee's指數(shù)及肝指數(shù)(P0.05)。3.高脂飲食組大鼠TC、TG、LDL、FFA、胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)、血清內(nèi)毒素以及肝臟TNF-α水平,較其余各組均顯著升高(P0.05),而HDL則顯著降低(P0.05),并且肝臟HE和油紅O染色可見明顯脂肪變性以及炎細(xì)胞浸潤。使用降脂益生菌、決明子總蒽醌以及聯(lián)合應(yīng)用干預(yù)后,均顯著降低了TC、TG、LDL、FFA,胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)、血清內(nèi)毒素以及肝臟TNF-α水平,并升高了HDL(P0.05),肝臟病理觀察,不同程度改善了肝臟脂肪變性以及炎細(xì)胞浸潤程度。4.與高脂飲食組相比,通過降脂益生菌、決明子總蒽醌以及二者聯(lián)合應(yīng)用的干預(yù),顯著上調(diào)了肝臟CYP7A1、LDLR m RNA,PPAR-α蛋白和腸道FXR m RNA的表達(dá),并下調(diào)肝臟中HMGCR m RNA以及SREBP-1c、PPAR-γ蛋白的表達(dá)(P0.05)。結(jié)論:降脂益生菌和決明子總蒽醌可以通過調(diào)節(jié)大鼠血脂水平,以及脂代謝相關(guān)基因的表達(dá),改善高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠,而且二者聯(lián)合應(yīng)用效果最為顯著。其具體機(jī)制可能是:通過上調(diào)肝臟中CYP7A1、LDLR m RNA,以及腸道FXR m RNA的表達(dá),并抑制SREBP-1c的生成,促進(jìn)膽固醇吸收和排泄。并下調(diào)肝臟中HMGCR m RNA的表達(dá),減少膽固醇合成。同時(shí)促進(jìn)肝臟中PPAR-α的表達(dá),抑制PPAR-γ的表達(dá),促進(jìn)膽固醇代謝,減少其外流的作用。從而調(diào)節(jié)了大鼠血脂代謝水平,改善了胰島素抵抗?fàn)顟B(tài),并降低了肝臟炎癥因子和腸源性內(nèi)毒素的釋放。第三部分降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌對非酒精性脂肪肝大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及腸黏膜屏障功能的影響目的:腸道菌群結(jié)構(gòu)和腸黏膜屏障功能在NAFLD發(fā)病過程中起重要作用。因此,在第二部分研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討降脂益生菌、決明子總蒽醌以及其聯(lián)合應(yīng)用,通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)和腸黏膜屏障完整性改善NAFLD的作用機(jī)制。材料與方法:1.通過糞便DNA提取試劑盒提取各組大鼠糞便樣本DNA,并對DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測,進(jìn)一步對V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增效果。2.通過Illumina Miseq平臺對大鼠腸道50、100、150天樣本進(jìn)行測序,并對序列進(jìn)行修剪和分類,獲取優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行分析。3.根據(jù)測序結(jié)果,對各組大鼠腸道菌群組成、物種豐度差異以及各組腸道菌群結(jié)構(gòu)的組間相似性進(jìn)行分析。4.病理切片觀察各組大鼠腸黏膜情況,Western-Blotting檢測腸黏膜緊密連接蛋白Occludin以及ZO-1表達(dá)情況。結(jié)果:1.對各組大鼠糞便樣本提取總DNA質(zhì)量檢測,OD260/OD280總體值均在1.8~2.0之間,并使用V4區(qū)引物,成功擴(kuò)增出條帶。2.通過Illumina Miseq高通量測序共得到7,583,846條序列信息,經(jīng)過修剪和篩選獲得5,740,971條優(yōu)質(zhì)序列,優(yōu)質(zhì)序列比例為75.7%,平均每個(gè)樣本63,788條,序列長度均在225~226bp之間。并且從序列的稀釋曲線可以看出足夠覆蓋腸道微生物中97%以上的菌種,且豐度分布均勻。3.對各組大鼠腸道菌群組成分析發(fā)現(xiàn),高脂飲食組腸道厚壁菌門比例增加顯著,并且擬桿菌門比例顯著減少。在分析大鼠腸道微生物屬水平時(shí),我們發(fā)現(xiàn)與正常飲食組相比,高脂飲食大鼠腸道擬桿菌屬、乳酸菌屬、變性菌屬豐度均顯著降低,而顫螺旋菌屬豐度卻顯著升高(P0.05)。通過降脂益生菌和決明子總蒽醌干預(yù),升高了擬桿菌屬、乳酸菌屬、變性菌屬豐度,并降低了顫螺旋菌屬豐度(P0.05)。降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌效果最為顯著。對各組大鼠腸道微生物的組成以及相似性,進(jìn)行了PCo A分析和聚類分析。結(jié)果顯示通過降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌干預(yù)的大鼠,腸道菌群結(jié)構(gòu)最接近于正常。熱圖的聚類分析也進(jìn)一步證實(shí)了此結(jié)果。4.病理觀察發(fā)現(xiàn)高脂飲食組大鼠小腸絨毛出現(xiàn)斷裂,缺失,間隙增寬,上皮細(xì)胞壞死、脫落的現(xiàn)象;并且腸道緊密連接蛋白Occludin以及ZO-1表達(dá)量較其它各組顯著降低(P0.05)。而通過降脂益生菌、決明子總蒽醌以及其聯(lián)合應(yīng)用干預(yù)后,各干預(yù)組絨毛排列較為整齊,缺失斷裂減少,形態(tài)有所恢復(fù);還增加了腸道緊密連接蛋白Occludin以及ZO-1表達(dá)量(P0.05)。結(jié)論:降脂益生菌、決明子總蒽醌以及其聯(lián)合應(yīng)用,均可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu),使失衡的腸道菌群更趨于正常,并促進(jìn)腸道緊密連接蛋白Occludin以及ZO-1的表達(dá),提高腸黏膜屏障完整性,從而起到改善NAFLD的作用。
【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575.5
【目錄】：

• 摘要4-10
• Abstract10-21
• 英文縮寫對照表21-23
• 前言23-26
• 第一部分 降脂益生菌的體外篩選及生物學(xué)特性研究26-49
• 引言26-27
• 材料與方法27-36
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-46
• 討論46-49
• 第二部分 降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌對非酒精性脂肪肝大鼠脂代謝及相關(guān)基因表達(dá)的影響49-86
• 引言49-51
• 材料與方法51-67
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果67-80
• 討論80-86
• 第三部分 降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌對非酒精性脂肪肝大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及腸黏膜屏障功能的影響86-110
• 引言86-87
• 材料與方法87-99
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果99-108
• 討論108-110
• 結(jié)論110-111
• 參考文獻(xiàn)111-119
• 綜述119-131
• 參考文獻(xiàn)128-131
• 個(gè)人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果131-133
• 致謝133

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本文編號：936843