本文關(guān)鍵詞：膽汁酸對(duì)梗阻性黃疸腸黏膜屏障的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究

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【摘要】：梗阻性黃疸(obstructive jaundice,OJ)導(dǎo)致排入腸腔內(nèi)的膽汁減少甚至缺如,引起腸腔內(nèi)細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng),內(nèi)毒素釋放增多,腸上皮細(xì)胞增殖減少,凋亡增多,腸黏膜緊密連接破壞,從而造成腸黏膜屏障損傷通透性增高。腸腔內(nèi)細(xì)菌及內(nèi)毒素通過(guò)損傷的腸黏膜進(jìn)入血液循環(huán),引起局部及全身感染,甚至造成敗血癥、全身炎癥反應(yīng)綜合征或多器官功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥。膽汁酸是膽汁的活性成分,人類膽汁酸主要包括初級(jí)膽汁酸(膽酸和鵝去氧膽酸)、次級(jí)膽汁酸(石膽酸和去氧膽酸)以及它們的甘氨酸和�；撬峤Y(jié)合形式。初級(jí)膽汁酸在腸道細(xì)菌作用下轉(zhuǎn)化為次級(jí)膽汁酸。膽汁酸是一種兩性分子,其主要功能是促進(jìn)脂質(zhì)和脂溶性維生素的消化和吸收。此外,膽汁酸還能夠調(diào)節(jié)腸道菌群,維持腸黏膜屏障的完整性。最近研究發(fā)現(xiàn)膽汁酸還可作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)自身生物合成,調(diào)節(jié)葡萄糖、脂質(zhì)、藥物和能量等代謝過(guò)程,并參與免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖、凋亡和分化。膽汁酸膜受體TGR5是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR),表達(dá)于多種器官和細(xì)胞,其中膽囊上皮和腸道表達(dá)最高。TGR5能夠調(diào)節(jié)代謝和膽汁酸平衡。激活TGR5可以增加能量消耗,明顯降低高脂飲食喂養(yǎng)小鼠的體重。TGR5可誘導(dǎo)腸內(nèi)分泌細(xì)胞分泌胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1),增加胰島素的敏感性,調(diào)節(jié)葡萄糖平衡。與野生型小鼠相比,TGR5敲除小鼠不僅總膽汁酸池容量降低,而且可抵抗膽固醇膽囊結(jié)石形成。TGR5還可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),發(fā)揮抗炎作用。最近研究表明,TGR5還具有抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用,例如給予�；悄懰猁}后可活化TGR5促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞的增殖。本課題重點(diǎn)研究膽汁對(duì)梗阻性黃疸時(shí)腸黏膜屏障的作用及TGR5的表達(dá)變化,并用動(dòng)物及細(xì)胞模型驗(yàn)證鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)是否通過(guò)上調(diào)TGR5的表達(dá)促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖,從而保護(hù)腸黏膜屏障。影響第一部分:膽汁對(duì)梗阻性黃疸患者腸黏膜屏障的作用及對(duì)TGR5表達(dá)的目的:觀察膽汁對(duì)梗阻性黃疸患者腸黏膜及TGR5表達(dá)的影響。方法:收集行內(nèi)鏡逆行胰膽管造影(ERCP)治療的惡性膽道梗阻伴黃疸患者16例;其中接受膽管支架置入術(shù)(ERBD)進(jìn)行膽汁內(nèi)引流(internal biliary drainage,ID)的患者8例,接受鼻膽管引流術(shù)(ENBD)進(jìn)行膽汁外引流(external biliary drainage,ED)的患者8例。所有患者在治療前和治療一周后取十二指腸乳頭以下2-5 cm范圍內(nèi)腸黏膜組織,觀察其形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的改變,應(yīng)用免疫組織化學(xué)(IHC)和Western blot方法檢測(cè)腸黏膜TGR5及增殖標(biāo)志物增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)的分布及表達(dá)變化。同時(shí)收集患者治療前后的血清,檢測(cè)血清中腸上皮細(xì)胞標(biāo)志酶二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)、腸型脂肪酸結(jié)合蛋白(intestinal fatty acid binding protein,I-FABP)以及腸內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)物內(nèi)毒素(Lipopolysaccharides,LPS)和D-乳酸(D-lactate)的水平。結(jié)果:①光鏡下觀察HE染色結(jié)果,ID組患者與治療前相比,腸黏膜絨毛較完整,上皮細(xì)胞排列相對(duì)整齊,腸黏膜損傷病理學(xué)評(píng)分為0.7±0.63,顯著低于治療前(2.5±0.37,P0.01)。ED組患者治療前后腸黏膜形態(tài)學(xué)無(wú)明顯變化,損傷病理學(xué)評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。②電鏡下觀察腸黏膜的超微結(jié)構(gòu),ID組患者與治療前相比,微絨毛排列整齊,數(shù)量增多,緊密連接間隙變窄;ED組患者治療前后,腸黏膜的超微結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化。③血清檢測(cè)結(jié)果顯示,ID組患者治療后DAO、I-FABP、LPS和D-lactate含量分別為57.23±8.6 U/L,149.6±29.16 pg/ml,0.2±0.02EU/ml,1.0±0.2 m M,均較治療前顯著下降(96.12±12.51 U/L,302.5±6103 pg/ml,0.39±0.04 EU/ml,1.68±0.18 m M,P0.05)。而ED組患者治療前后血清DAO、I-FABP、LPS、和D-lactate含量無(wú)顯著差異(P0.05)。④IHC顯示PCNA主要在腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞核表達(dá),TGR5主要表達(dá)于腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜。ID組患者治療后,PCNA和TGR5的表達(dá)高于治療前,而ED組患者治療前后,PCNA和TGR5的表達(dá)無(wú)明顯差異。Western blot分析結(jié)果與免疫組化一致,ID組患者治療后PCNA和TGR5的表達(dá)均較治療前增多(P0.05,P0.01),而ED組患者治療前后PCNA和TGR5的表達(dá)無(wú)顯著差別(P0.05)。結(jié)論:膽汁能夠促進(jìn)梗阻性黃疸患者腸黏膜上皮細(xì)胞增殖,改善腸黏膜形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu),降低其通透性,并增加TGR5的表達(dá)。TGR5可能與腸上皮細(xì)胞增殖有關(guān)。第二部分:膽汁酸對(duì)梗阻性黃疸大鼠腸黏膜屏障的作用及對(duì)TGR5表達(dá)的影響目的:建立梗阻性黃疸大鼠動(dòng)物模型,探討膽汁酸CDCA對(duì)腸黏膜屏障的作用及對(duì)腸黏膜TGR5表達(dá)的影響。方法:將30只Wistar大鼠隨機(jī)分為3組,假手術(shù)組(sham operation,SHAM),膽總管結(jié)扎組+溶劑組(bile duct ligated+Vehicle,BDL+Vehicle),膽總管結(jié)扎+CDCA組(BDL+CDCA)。1周后取末端回腸黏膜組織觀察其形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變,應(yīng)用IHC和Western blot方法檢測(cè)腸黏膜TGR5、PCNA分布及表達(dá)的變化。同時(shí),檢測(cè)血清中DAO、I-FABP、LPS和D-lactate的水平。結(jié)果:①HE染色結(jié)果顯示,SHAM組腸黏膜絨毛及上皮細(xì)胞排列整齊;BDL+Vehicle組腸黏膜的完整性被破壞,表現(xiàn)為小腸絨毛短粗,絨毛頂端上皮下間隙增大,上皮層與固有層分離;BDL+CDCA組腸黏膜絨毛較完整,上皮細(xì)胞排列相對(duì)整齊,腸黏膜損傷病理學(xué)評(píng)分為1.8±0.2,顯著低于BDL+Vehicle組(2.6±0.16,P0.01)。②電鏡下觀察腸黏膜超微結(jié)構(gòu),SHAM組腸黏膜微絨毛排列整齊、緊密;BDL+Vehicle組腸黏膜微絨毛明顯稀疏,緊密連接間隙增寬,胞漿有空泡形成;BDL+CDCA組腸黏膜微絨毛排列相對(duì)整齊,胞漿中未見(jiàn)空泡形成。③與SHAM組相比,BDL+Vehicle組血清DAO、I-FABP、LPS和D-lactate含量明顯升高;而BDL+CDCA組與BDL+Vehicle組相比,血清DAO、I-FABP、LPS和D-lactate含量明顯下降(P0.001)。④IHC顯示,PCNA主要在細(xì)胞核表達(dá),TGR5主要在細(xì)胞膜表達(dá)。BDL+Vehicle組腸黏膜PCNA和TGR5的表達(dá)均較SHAM組下降。而與BDL+Vehicle組相比,BDL+CDCA組腸黏膜PCNA和TGR5的表達(dá)明顯升高。Western blot分析結(jié)果與免疫組化一致,BDL+Vehicle組腸黏膜PCNA和TGR5的表達(dá)均較SHAM組減少,而與BDL+Vehicle組相比,BDL+CDCA組腸黏膜PCNA和TGR5的表達(dá)明顯升高(P0.01)。結(jié)論:膽汁酸CDCA能夠促進(jìn)梗阻性黃疸大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞增殖,改善腸黏膜形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu),降低其通透性,并上調(diào)TGR5的表達(dá)。TGR5可能與腸上皮細(xì)胞增殖有關(guān)。第三部分:膽汁酸通過(guò)上調(diào)TGR5表達(dá)促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖目的:探討CDCA是否通過(guò)TGR5的表達(dá)促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖。方法:用LPS誘導(dǎo)人小腸上皮細(xì)胞株FHs 74 Int損傷,作為梗阻性黃疸腸黏膜損傷的細(xì)胞模型,觀察膽汁酸CDCA刺激對(duì)LPS誘導(dǎo)的FHs 74Int損傷的影響。實(shí)驗(yàn)分四組:對(duì)照組(control)、CDCA組、LPS組和LPS+CDCA組。給予LPS(1 mg/ml)和/或CDCA(100μM)處理FHs 74Int細(xì)胞48 h,收集細(xì)胞。以慢病毒為載體在FHs 74 Int細(xì)胞中敲低和過(guò)表達(dá)TGR5,觀察TGR5與腸上皮細(xì)胞增殖的關(guān)系。用RT-real time PCR及Western blot分析分別從m RNA水平及蛋白水平觀察敲低及過(guò)表達(dá)效果。在TGR5敲低的FHs 74 Int細(xì)胞中,應(yīng)用LPS(1 mg/ml)處理細(xì)胞48 h,實(shí)驗(yàn)分四組:對(duì)照組(Lv-sh Con)、TGR5敲低組(Lv-sh TGR5)、Lv-sh Con+LPS和Lv-sh TGR5+LPS。在TGR5過(guò)表達(dá)的FHs 74 Int細(xì)胞中,應(yīng)用LPS(1 mg/ml)處理細(xì)胞48 h,試驗(yàn)分四組:對(duì)照組(Lv-Flag)、TGR5過(guò)表達(dá)組(Lv-TGR5)、Lv-Flag+LPS和Lv-TGR5+LPS。為進(jìn)一步證明CDCA能夠通過(guò)TGR5促進(jìn)細(xì)胞增殖,給予LPS和/或CDCA刺激TGR5敲低的FHs 74 Int細(xì)胞48 h,試驗(yàn)分四組:Lv-sh Con、Lv-sh Con+LPS、Lv-sh Con+LPS+CDCA和Lv-sh TGR5+LPS+CDCA。收集上述分組細(xì)胞,用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期,Ed U檢測(cè)細(xì)胞DNA合成情況,綜合反映細(xì)胞增殖水平。應(yīng)用Western blot分析檢測(cè)PCNA及TGR5的表達(dá)。結(jié)果:①CCK-8分析結(jié)果表明,LPS刺激基礎(chǔ)上加入CDCA處理后,FHs 74 Int細(xì)胞活力顯著高于單純LPS損傷組。流式細(xì)胞周期結(jié)果顯示,LPS損傷基礎(chǔ)上加入CDCA處理后,較LPS損傷組,S期細(xì)胞比例上升,而G0/G1期細(xì)胞比例下降。Ed U結(jié)果與CCK-8及細(xì)胞周期結(jié)果一致,LPS+CDCA組與LPS組相比,DNA合成增加。以上結(jié)果表明,CDCA處理可對(duì)抗LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制。Western blot分析結(jié)果表明,LPS處理可抑制PCNA和TGR5表達(dá),加入CDCA處理后,PCNA和TGR5表達(dá)較LPS損傷組顯著升高,結(jié)果提示,膽汁酸可促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖及TGR5表達(dá),二者具有一定正相關(guān)關(guān)系。②CCK-8分析結(jié)果表明,LPS刺激后,細(xì)胞活力減低,而用Lv-sh TGR5敲低內(nèi)源性TGR5的表達(dá)后,細(xì)胞活力降低更為顯著。細(xì)胞周期結(jié)果顯示,LPS處理后,G0/G1期細(xì)胞比例上升,S期細(xì)胞比例下降,表明細(xì)胞被阻滯于G0/G1期,TGR5敲低組的G0/G1期阻滯更明顯。Ed U結(jié)果顯示,LPS處理后,細(xì)胞DNA合成受抑制,而TGR5敲低后,FHs 74 Int細(xì)胞的DNA合成進(jìn)一步被抑制。Western blot分析表明,LPS可顯著抑制增殖標(biāo)志蛋白PCNA的表達(dá),敲低TGR5可進(jìn)一步下調(diào)PCNA水平。以上結(jié)果表明,敲低TGR5促進(jìn)LPS對(duì)FHs 74Int細(xì)胞增殖的抑制,提示TGR5可促進(jìn)細(xì)胞增殖。③CCK-8分析結(jié)果顯示,在TGR5過(guò)表達(dá)及對(duì)照組細(xì)胞中,LPS刺激后,細(xì)胞活力均減低,而TGR5過(guò)表達(dá)組細(xì)胞活力較對(duì)照組有所升高。細(xì)胞周期結(jié)果顯示,LPS處理后,G0/G1期細(xì)胞比例上升,而S期細(xì)胞比例下降,表明細(xì)胞被阻滯于G0/G1期,而TGR5過(guò)表達(dá)組的G0/G1期阻滯較對(duì)照組有所減輕。Ed U結(jié)果顯示,LPS處理后,細(xì)胞DNA合成受抑制,而過(guò)表達(dá)TGR5可減弱LPS誘導(dǎo)的DNA合成抑制。Western blot分析表明,LPS可顯著抑制增殖標(biāo)志蛋白PCNA的表達(dá),而過(guò)表達(dá)TGR5可抑制LPS引起的PCNA下調(diào)。結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)TGR5可減弱LPS對(duì)FHs 74 Int細(xì)胞增殖的抑制,提示TGR5可促進(jìn)細(xì)胞增殖。④LPS刺激后,細(xì)胞活力降低,G0/G1期細(xì)胞比例上升,S期細(xì)胞比例下降,DNA合成減少,PCNA下調(diào),表明LPS可顯著抑制細(xì)胞增殖。在LPS損傷的FHs 74 Int中加入CDCA后,細(xì)胞活力升高,G0/G1期細(xì)胞比例降低,S期細(xì)胞比例升高,DNA合成增加,PCNA上調(diào),表明CDCA可減弱LPS對(duì)FHs 74 Int的增殖抑制。而在TGR5敲低的細(xì)胞中,CDCA刺激不能對(duì)抗LPS對(duì)FHs 74 Int的增殖抑制作用,表現(xiàn)為L(zhǎng)v-sh TGR5+LPS+CDCA組較Lv-sh Con+LPS+CDCA組,細(xì)胞活力降低,G0/G1期細(xì)胞比例上升,S期細(xì)胞比例下降,DNA合成減少,PCNA下調(diào)。結(jié)論:膽汁酸通過(guò)上調(diào)TGR5的表達(dá)促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖。
【關(guān)鍵詞】：梗阻性黃疸 腸黏膜屏障 膽汁內(nèi)引流 膽汁酸 膽汁酸受體TGR5 細(xì)胞增殖
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R575
【目錄】：

• 中文摘要5-10
• 英文摘要10-18
• 英文縮寫18-20
• 引言20-22
• 第一部分 膽汁對(duì)梗阻性黃疸患者腸黏膜屏障的作用及TGR5表達(dá)的影響22-51
• 前言22-23
• 材料與方法23-35
• 結(jié)果35-37
• 附圖37-43
• 附表43-45
• 討論45-47
• 小結(jié)47-48
• 參考文獻(xiàn)48-51
• 第二部分 膽汁酸對(duì)梗阻性黃疸大鼠腸黏膜屏障的作用及TGR5表達(dá)的影響51-74
• 前言51-52
• 材料與方法52-64
• 結(jié)果64-66
• 附圖66-69
• 附表69-70
• 討論70-71
• 小結(jié)71
• 參考文獻(xiàn)71-74
• 第三部分 膽汁酸通過(guò)上調(diào)TGR5表達(dá)促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖74-104
• 前言74-75
• 材料與方法75-86
• 結(jié)果86-91
• 附圖91-100
• 討論100-102
• 小結(jié)102
• 參考文獻(xiàn)102-104
• 結(jié)論104-105
• 綜述 膽汁酸膜受體TGR5研究進(jìn)展105-125
• 參考文獻(xiàn)116-125
• 致謝125-126
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷12

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