本文關鍵詞：膽汁酸對梗阻性黃疸腸黏膜屏障的保護作用及其機制的研究

  更多相關文章： 梗阻性黃疸 腸黏膜屏障 膽汁內引流 膽汁酸 膽汁酸受體TGR5 細胞增殖

【摘要】：梗阻性黃疸(obstructive jaundice,OJ)導致排入腸腔內的膽汁減少甚至缺如,引起腸腔內細菌過度生長,內毒素釋放增多,腸上皮細胞增殖減少,凋亡增多,腸黏膜緊密連接破壞,從而造成腸黏膜屏障損傷通透性增高。腸腔內細菌及內毒素通過損傷的腸黏膜進入血液循環(huán),引起局部及全身感染,甚至造成敗血癥、全身炎癥反應綜合征或多器官功能衰竭等嚴重并發(fā)癥。膽汁酸是膽汁的活性成分,人類膽汁酸主要包括初級膽汁酸(膽酸和鵝去氧膽酸)、次級膽汁酸(石膽酸和去氧膽酸)以及它們的甘氨酸和�；撬峤Y合形式。初級膽汁酸在腸道細菌作用下轉化為次級膽汁酸。膽汁酸是一種兩性分子,其主要功能是促進脂質和脂溶性維生素的消化和吸收。此外,膽汁酸還能夠調節(jié)腸道菌群,維持腸黏膜屏障的完整性。最近研究發(fā)現膽汁酸還可作為信號分子調節(jié)自身生物合成,調節(jié)葡萄糖、脂質、藥物和能量等代謝過程,并參與免疫反應、細胞增殖、凋亡和分化。膽汁酸膜受體TGR5是G蛋白偶聯受體(GPCR),表達于多種器官和細胞,其中膽囊上皮和腸道表達最高。TGR5能夠調節(jié)代謝和膽汁酸平衡。激活TGR5可以增加能量消耗,明顯降低高脂飲食喂養(yǎng)小鼠的體重。TGR5可誘導腸內分泌細胞分泌胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1),增加胰島素的敏感性,調節(jié)葡萄糖平衡。與野生型小鼠相比,TGR5敲除小鼠不僅總膽汁酸池容量降低,而且可抵抗膽固醇膽囊結石形成。TGR5還可以調節(jié)免疫反應,發(fā)揮抗炎作用。最近研究表明,TGR5還具有抑制細胞凋亡、促進細胞增殖的作用,例如給予�；悄懰猁}后可活化TGR5促進膽管上皮細胞的增殖。本課題重點研究膽汁對梗阻性黃疸時腸黏膜屏障的作用及TGR5的表達變化,并用動物及細胞模型驗證鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)是否通過上調TGR5的表達促進腸上皮細胞增殖,從而保護腸黏膜屏障。影響第一部分:膽汁對梗阻性黃疸患者腸黏膜屏障的作用及對TGR5表達的目的:觀察膽汁對梗阻性黃疸患者腸黏膜及TGR5表達的影響。方法:收集行內鏡逆行胰膽管造影(ERCP)治療的惡性膽道梗阻伴黃疸患者16例;其中接受膽管支架置入術(ERBD)進行膽汁內引流(internal biliary drainage,ID)的患者8例,接受鼻膽管引流術(ENBD)進行膽汁外引流(external biliary drainage,ED)的患者8例。所有患者在治療前和治療一周后取十二指腸乳頭以下2-5 cm范圍內腸黏膜組織,觀察其形態(tài)學及超微結構的改變,應用免疫組織化學(IHC)和Western blot方法檢測腸黏膜TGR5及增殖標志物增殖細胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)的分布及表達變化。同時收集患者治療前后的血清,檢測血清中腸上皮細胞標志酶二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)、腸型脂肪酸結合蛋白(intestinal fatty acid binding protein,I-FABP)以及腸內細菌產物內毒素(Lipopolysaccharides,LPS)和D-乳酸(D-lactate)的水平。結果:①光鏡下觀察HE染色結果,ID組患者與治療前相比,腸黏膜絨毛較完整,上皮細胞排列相對整齊,腸黏膜損傷病理學評分為0.7±0.63,顯著低于治療前(2.5±0.37,P0.01)。ED組患者治療前后腸黏膜形態(tài)學無明顯變化,損傷病理學評分無統(tǒng)計學差異(P0.05)。②電鏡下觀察腸黏膜的超微結構,ID組患者與治療前相比,微絨毛排列整齊,數量增多,緊密連接間隙變窄;ED組患者治療前后,腸黏膜的超微結構無明顯變化。③血清檢測結果顯示,ID組患者治療后DAO、I-FABP、LPS和D-lactate含量分別為57.23±8.6 U/L,149.6±29.16 pg/ml,0.2±0.02EU/ml,1.0±0.2 m M,均較治療前顯著下降(96.12±12.51 U/L,302.5±6103 pg/ml,0.39±0.04 EU/ml,1.68±0.18 m M,P0.05)。而ED組患者治療前后血清DAO、I-FABP、LPS、和D-lactate含量無顯著差異(P0.05)。④IHC顯示PCNA主要在腸上皮細胞的細胞核表達,TGR5主要表達于腸上皮細胞的細胞膜。ID組患者治療后,PCNA和TGR5的表達高于治療前,而ED組患者治療前后,PCNA和TGR5的表達無明顯差異。Western blot分析結果與免疫組化一致,ID組患者治療后PCNA和TGR5的表達均較治療前增多(P0.05,P0.01),而ED組患者治療前后PCNA和TGR5的表達無顯著差別(P0.05)。結論:膽汁能夠促進梗阻性黃疸患者腸黏膜上皮細胞增殖,改善腸黏膜形態(tài)學及超微結構,降低其通透性,并增加TGR5的表達。TGR5可能與腸上皮細胞增殖有關。第二部分:膽汁酸對梗阻性黃疸大鼠腸黏膜屏障的作用及對TGR5表達的影響目的:建立梗阻性黃疸大鼠動物模型,探討膽汁酸CDCA對腸黏膜屏障的作用及對腸黏膜TGR5表達的影響。方法:將30只Wistar大鼠隨機分為3組,假手術組(sham operation,SHAM),膽總管結扎組+溶劑組(bile duct ligated+Vehicle,BDL+Vehicle),膽總管結扎+CDCA組(BDL+CDCA)。1周后取末端回腸黏膜組織觀察其形態(tài)學及超微結構改變,應用IHC和Western blot方法檢測腸黏膜TGR5、PCNA分布及表達的變化。同時,檢測血清中DAO、I-FABP、LPS和D-lactate的水平。結果:①HE染色結果顯示,SHAM組腸黏膜絨毛及上皮細胞排列整齊;BDL+Vehicle組腸黏膜的完整性被破壞,表現為小腸絨毛短粗,絨毛頂端上皮下間隙增大,上皮層與固有層分離;BDL+CDCA組腸黏膜絨毛較完整,上皮細胞排列相對整齊,腸黏膜損傷病理學評分為1.8±0.2,顯著低于BDL+Vehicle組(2.6±0.16,P0.01)。②電鏡下觀察腸黏膜超微結構,SHAM組腸黏膜微絨毛排列整齊、緊密;BDL+Vehicle組腸黏膜微絨毛明顯稀疏,緊密連接間隙增寬,胞漿有空泡形成;BDL+CDCA組腸黏膜微絨毛排列相對整齊,胞漿中未見空泡形成。③與SHAM組相比,BDL+Vehicle組血清DAO、I-FABP、LPS和D-lactate含量明顯升高;而BDL+CDCA組與BDL+Vehicle組相比,血清DAO、I-FABP、LPS和D-lactate含量明顯下降(P0.001)。④IHC顯示,PCNA主要在細胞核表達,TGR5主要在細胞膜表達。BDL+Vehicle組腸黏膜PCNA和TGR5的表達均較SHAM組下降。而與BDL+Vehicle組相比,BDL+CDCA組腸黏膜PCNA和TGR5的表達明顯升高。Western blot分析結果與免疫組化一致,BDL+Vehicle組腸黏膜PCNA和TGR5的表達均較SHAM組減少,而與BDL+Vehicle組相比,BDL+CDCA組腸黏膜PCNA和TGR5的表達明顯升高(P0.01)。結論:膽汁酸CDCA能夠促進梗阻性黃疸大鼠腸黏膜上皮細胞增殖,改善腸黏膜形態(tài)學及超微結構,降低其通透性,并上調TGR5的表達。TGR5可能與腸上皮細胞增殖有關。第三部分:膽汁酸通過上調TGR5表達促進腸上皮細胞增殖目的:探討CDCA是否通過TGR5的表達促進腸上皮細胞增殖。方法:用LPS誘導人小腸上皮細胞株FHs 74 Int損傷,作為梗阻性黃疸腸黏膜損傷的細胞模型,觀察膽汁酸CDCA刺激對LPS誘導的FHs 74Int損傷的影響。實驗分四組:對照組(control)、CDCA組、LPS組和LPS+CDCA組。給予LPS(1 mg/ml)和/或CDCA(100μM)處理FHs 74Int細胞48 h,收集細胞。以慢病毒為載體在FHs 74 Int細胞中敲低和過表達TGR5,觀察TGR5與腸上皮細胞增殖的關系。用RT-real time PCR及Western blot分析分別從m RNA水平及蛋白水平觀察敲低及過表達效果。在TGR5敲低的FHs 74 Int細胞中,應用LPS(1 mg/ml)處理細胞48 h,實驗分四組:對照組(Lv-sh Con)、TGR5敲低組(Lv-sh TGR5)、Lv-sh Con+LPS和Lv-sh TGR5+LPS。在TGR5過表達的FHs 74 Int細胞中,應用LPS(1 mg/ml)處理細胞48 h,試驗分四組:對照組(Lv-Flag)、TGR5過表達組(Lv-TGR5)、Lv-Flag+LPS和Lv-TGR5+LPS。為進一步證明CDCA能夠通過TGR5促進細胞增殖,給予LPS和/或CDCA刺激TGR5敲低的FHs 74 Int細胞48 h,試驗分四組:Lv-sh Con、Lv-sh Con+LPS、Lv-sh Con+LPS+CDCA和Lv-sh TGR5+LPS+CDCA。收集上述分組細胞,用CCK-8檢測細胞活力,流式細胞術檢測細胞周期,Ed U檢測細胞DNA合成情況,綜合反映細胞增殖水平。應用Western blot分析檢測PCNA及TGR5的表達。結果:①CCK-8分析結果表明,LPS刺激基礎上加入CDCA處理后,FHs 74 Int細胞活力顯著高于單純LPS損傷組。流式細胞周期結果顯示,LPS損傷基礎上加入CDCA處理后,較LPS損傷組,S期細胞比例上升,而G0/G1期細胞比例下降。Ed U結果與CCK-8及細胞周期結果一致,LPS+CDCA組與LPS組相比,DNA合成增加。以上結果表明,CDCA處理可對抗LPS誘導的細胞增殖抑制。Western blot分析結果表明,LPS處理可抑制PCNA和TGR5表達,加入CDCA處理后,PCNA和TGR5表達較LPS損傷組顯著升高,結果提示,膽汁酸可促進腸上皮細胞增殖及TGR5表達,二者具有一定正相關關系。②CCK-8分析結果表明,LPS刺激后,細胞活力減低,而用Lv-sh TGR5敲低內源性TGR5的表達后,細胞活力降低更為顯著。細胞周期結果顯示,LPS處理后,G0/G1期細胞比例上升,S期細胞比例下降,表明細胞被阻滯于G0/G1期,TGR5敲低組的G0/G1期阻滯更明顯。Ed U結果顯示,LPS處理后,細胞DNA合成受抑制,而TGR5敲低后,FHs 74 Int細胞的DNA合成進一步被抑制。Western blot分析表明,LPS可顯著抑制增殖標志蛋白PCNA的表達,敲低TGR5可進一步下調PCNA水平。以上結果表明,敲低TGR5促進LPS對FHs 74Int細胞增殖的抑制,提示TGR5可促進細胞增殖。③CCK-8分析結果顯示,在TGR5過表達及對照組細胞中,LPS刺激后,細胞活力均減低,而TGR5過表達組細胞活力較對照組有所升高。細胞周期結果顯示,LPS處理后,G0/G1期細胞比例上升,而S期細胞比例下降,表明細胞被阻滯于G0/G1期,而TGR5過表達組的G0/G1期阻滯較對照組有所減輕。Ed U結果顯示,LPS處理后,細胞DNA合成受抑制,而過表達TGR5可減弱LPS誘導的DNA合成抑制。Western blot分析表明,LPS可顯著抑制增殖標志蛋白PCNA的表達,而過表達TGR5可抑制LPS引起的PCNA下調。結果表明,過表達TGR5可減弱LPS對FHs 74 Int細胞增殖的抑制,提示TGR5可促進細胞增殖。④LPS刺激后,細胞活力降低,G0/G1期細胞比例上升,S期細胞比例下降,DNA合成減少,PCNA下調,表明LPS可顯著抑制細胞增殖。在LPS損傷的FHs 74 Int中加入CDCA后,細胞活力升高,G0/G1期細胞比例降低,S期細胞比例升高,DNA合成增加,PCNA上調,表明CDCA可減弱LPS對FHs 74 Int的增殖抑制。而在TGR5敲低的細胞中,CDCA刺激不能對抗LPS對FHs 74 Int的增殖抑制作用,表現為Lv-sh TGR5+LPS+CDCA組較Lv-sh Con+LPS+CDCA組,細胞活力降低,G0/G1期細胞比例上升,S期細胞比例下降,DNA合成減少,PCNA下調。結論:膽汁酸通過上調TGR5的表達促進腸上皮細胞增殖。
【關鍵詞】：梗阻性黃疸 腸黏膜屏障 膽汁內引流 膽汁酸 膽汁酸受體TGR5 細胞增殖
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575
【目錄】：

• 中文摘要5-10
• 英文摘要10-18
• 英文縮寫18-20
• 引言20-22
• 第一部分 膽汁對梗阻性黃疸患者腸黏膜屏障的作用及TGR5表達的影響22-51
• 前言22-23
• 材料與方法23-35
• 結果35-37
• 附圖37-43
• 附表43-45
• 討論45-47
• 小結47-48
• 參考文獻48-51
• 第二部分 膽汁酸對梗阻性黃疸大鼠腸黏膜屏障的作用及TGR5表達的影響51-74
• 前言51-52
• 材料與方法52-64
• 結果64-66
• 附圖66-69
• 附表69-70
• 討論70-71
• 小結71
• 參考文獻71-74
• 第三部分 膽汁酸通過上調TGR5表達促進腸上皮細胞增殖74-104
• 前言74-75
• 材料與方法75-86
• 結果86-91
• 附圖91-100
• 討論100-102
• 小結102
• 參考文獻102-104
• 結論104-105
• 綜述 膽汁酸膜受體TGR5研究進展105-125
• 參考文獻116-125
• 致謝125-126
• 個人簡歷12

【相似文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

1 邱明鏈,陳思曾;免疫營養(yǎng)素在腸黏膜屏障功能障礙中的作用[J];福建醫(yī)科大學學報;2005年S1期

2 李世榮,楊欣艷;腸黏膜屏障與疾病[J];中華醫(yī)學雜志;2005年39期

3 郝彥開;馮麗英;王軍民;;組織胺對腸黏膜屏障保護作用的研究[J];中國實驗診斷學;2008年12期

4 李世榮;;腸黏膜屏障與抗生素相關性腸炎[J];中國醫(yī)藥導刊;2008年02期

5 席豐;高金生;楊書良;;組胺對腸黏膜屏障的保護作用[J];新醫(yī)學;2009年04期

6 徐璇;吳堅;;危重癥腸黏膜屏障功能障礙的機制研究[J];醫(yī)學綜述;2009年13期

7 盧書明;劉麗娜;;重視腸黏膜屏障功能障礙的防治[J];醫(yī)學與哲學(臨床決策論壇版);2011年05期

8 ;更正[J];中國中西醫(yī)結合外科雜志;2013年04期

9 田亭;邱玉梅;周宇;;腸黏膜屏障在潰瘍性結腸炎發(fā)病機制中的研究現狀[J];現代消化及介入診療;2013年05期

10 張紅金,湯大明,陳德昌;大劑量維生素C對腸黏膜屏障的保護作用[J];中國急救醫(yī)學;2003年02期

中國重要會議論文全文數據庫 前10條

1 樊春華;呂永慧;;腸黏膜屏障功能障礙的中西醫(yī)診治研究進展[A];中華中醫(yī)藥學會脾胃病分會第二十三次全國脾胃病學術交流會論文匯編[C];2011年

2 王裴;王鳳君;;腸黏膜屏障功能的評估[A];第八屆西南五省一市燒傷整形學術會議暨貴州省醫(yī)學會燒傷整形分會2010年學術年會論文匯編[C];2010年

3 張家平;黃躍生;楊宗城;;燒傷延遲復蘇加重早期腸黏膜屏障功能損害及機制研究[A];全國燒傷創(chuàng)面處理、感染專題研討會論文匯編[C];2004年

4 呂永慧;;中醫(yī)藥在炎癥性腸病中改善腸黏膜屏障功能障礙的作用[A];中華中醫(yī)藥學會第二十二屆全國脾胃病學術交流會暨2010年脾胃病診療新進展學習班論文匯編[C];2010年

5 彭曦;汪仕良;;谷氨酰胺維護腸黏膜屏障機制的再認識[A];第八屆西南五省一市燒傷整形學術會議暨貴州省醫(yī)學會燒傷整形分會2010年學術年會論文匯編[C];2010年

6 李鋼;;腸黏膜屏障的現代概念[A];第九屆全國中西醫(yī)結合普通外科學術交流大會暨膽道胰腺疾病新進展學習班論文匯編[C];2005年

7 程君濤;肖光夏;馮智;李小毅;;腹內高壓致腸黏膜屏障損傷作用的研究[A];第四屆全國燒傷救治專題研討會燒傷感染救治新進展論文匯編[C];2006年

8 季峰;駱丹東;;大黃素對大鼠實驗性重癥急性胰腺炎腸黏膜屏障的影響[A];首屆浙江省消化病學術大會論文匯編[C];2008年

9 唐銀河;施紅旗;余正平;廖毅;;血中PEG4000含量監(jiān)測腸黏膜屏障障礙實驗研究[A];《中華急診醫(yī)學雜志社》第三屆組稿會暨急診醫(yī)學學術研討會論文匯編[C];2004年

10 張培趁;石玲燕;周鋒;余作黔;余震;;ω-3魚油脂肪乳對重癥急性胰腺炎腸黏膜屏障功能的影響[A];2013年浙江省腸外腸內營養(yǎng)學學術年會論文匯編[C];2013年

中國重要報紙全文數據庫 前2條

1 解放軍153醫(yī)院感染科主任 王全楚;理念更新 治肝先治腸[N];健康報;2011年

2 本報記者 林洵;功能醫(yī)學 讓診療前移[N];健康報;2012年

中國博士學位論文全文數據庫 前7條

1 曹建春;通腑湯對腹腔間隔室綜合征腸黏膜屏障的干預作用[D];北京中醫(yī)藥大學;2006年

2 劉圣p，

本文編號：931333