本文關(guān)鍵詞：HBsAg和抗HBs雙陽(yáng)性患者S基因新增N-糖基化突變的臨床意義分析

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【摘要】：目的:分析HBV(Hepatitis B virus,HBV)HBsAg+抗HBs雙陽(yáng)性患者S基因主要親水區(qū)(major hydrophilic region,MHR)新增N-糖基化突變特點(diǎn),揭示HBsAg+抗HBs雙陽(yáng)性的發(fā)生機(jī)制和臨床意義。方法:對(duì)284例HBsAg+抗HBs雙陽(yáng)性和314例HBsAg單陽(yáng)性乙型肝炎病毒感染者S基因擴(kuò)增及測(cè)序分析。對(duì)1例攜有MHR區(qū)雙N-糖基化新型突變株的慢性乙肝患者血清樣本進(jìn)行隨訪收集和深入研究,對(duì)HBV前S/S基因進(jìn)行擴(kuò)增和克隆測(cè)序,觀察新增雙N-糖基化突變的演變過(guò)程。構(gòu)建pcDNA3.1(-)-myc-His A和pTriEx-mod-1.1HBV野生株、2種臨床變異株和定點(diǎn)回復(fù)突變株重組質(zhì)粒,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV DNA和細(xì)胞內(nèi)復(fù)制中間體水平,分析突變對(duì)病毒復(fù)制力和分泌能力的影響,并對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBs Ag進(jìn)行絕對(duì)定量,同時(shí)采用Western blotting和免疫熒光技術(shù)對(duì)HBsAg-His融合蛋白進(jìn)行檢測(cè),分析突變對(duì)病毒抗原性的影響。結(jié)果:284例HBsAg+抗HBs雙陽(yáng)性患者中MHR區(qū)新增N-糖基化突變的檢出率為11.3%(32/284),顯著高于314例HBsAg單陽(yáng)性患者的2.9%(9/314)(P0.01)。284例HBsAg+抗HBs雙陽(yáng)性患者中72例為肝細(xì)胞癌(Hepatocellμlar carcinoma,HCC),在HBsAg+抗HBs雙陽(yáng)性伴新增N-糖基化突變者中檢出率為46.9%(15/32),顯著高于HBsAg+抗HBs雙陽(yáng)性未伴新增N-糖基化突變的22.6%(57/252)(P0.01)。從1例患者中檢出的新型株突變形式為s116-118TST→NST+s131-133TSM→NST,并聯(lián)合sP120缺失+G145D突變,在3份隨訪樣本中該突變株分別占98.0%、2.0%和2.5%,在第2份樣本中檢出s130-132GTS→NSS單N-糖基化突變株,占17.6%,但無(wú)sP120缺失+G145D聯(lián)合突變。與野生株相比,新型突變株復(fù)制力提高31%,但HBsAg定量降低。免疫熒光結(jié)果顯示,雙N-糖基化定點(diǎn)回復(fù)突變株可部分恢復(fù)HBsAg檢出水平,提示除雙N-糖基化突變外,s P120缺失+G145D聯(lián)合突變對(duì)HBsAg抗原性減弱也有明顯影響。結(jié)論:HBV S基因MHR區(qū)新增N-糖基化突變與HBsAg+抗HBs雙陽(yáng)性相關(guān),兩者同時(shí)出現(xiàn)可能是HCC發(fā)生的高風(fēng)險(xiǎn)因素;S基因MHR區(qū)新增雙N-糖基化+sP120缺失+sG145D聯(lián)合突變共同影響HBsAg抗原性。
【關(guān)鍵詞】：乙型肝炎病毒 S基因 突變 復(fù)制力 抗原性
【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.62
【目錄】：

• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 英漢縮略詞對(duì)照表13-15
• 前言15-17
• 第一部分 臨床樣本篩查分析HBV S基因新增N-糖基化突變17-26
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器17-18
• 1.1.1 研究對(duì)象17
• 1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑17-18
• 1.1.3 主要儀器18
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法18-22
• 1.2.1 血清中HBV DNA的提取18-19
• 1.2.2 巢式PCR擴(kuò)增HBV S區(qū)序列19-22
• 1.2.2.1 第一輪PCR擴(kuò)增19-20
• 1.2.2.2 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)20
• 1.2.2.3 第2輪PCR擴(kuò)增20-22
• 1.2.2.4 PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)22
• 1.2.3 測(cè)序及分析22
• 1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法22
• 1.3 結(jié)果22-23
• 1.3.1 巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果22-23
• 1.3.2 HBV S區(qū)基因新增N-糖基化突變臨床數(shù)據(jù)分析結(jié)果23
• 1.4 結(jié)論23-24
• 1.5 討論24-26
• 第二部分 HBsAg+抗HBs雙陽(yáng)性伴S區(qū)新增雙N-糖基化突變臨床意義分析的實(shí)驗(yàn)研究26-69
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器26-29
• 2.1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器26
• 2.1.2 主要試劑26-28
• 2.1.3 研究對(duì)象28-29
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法29-56
• 2.2.1 巢式PCR擴(kuò)增HBV前S/S序列29-31
• 2.2.1.1 巢式第1輪PCR擴(kuò)增29-30
• 2.2.1.2 第2輪PCR擴(kuò)增30-31
• 2.2.1.3 PCR產(chǎn)物的檢測(cè)31
• 2.2.2 HBV前S/S區(qū)序列的克隆及測(cè)序分析31-36
• 2.2.2.1 PCR產(chǎn)物純化32
• 2.2.2.2 PCR產(chǎn)物末端加A32-33
• 2.2.2.3 與T載體連接33
• 2.2.2.4 轉(zhuǎn)化33-34
• 2.2.2.5 挑菌及搖菌34
• 2.2.2.6 菌液PCR34-35
• 2.2.2.7 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)35
• 2.2.2.8 測(cè)序分析35-36
• 2.2.2.9 小提質(zhì)粒36
• 2.2.3 定點(diǎn)突變36-38
• 2.2.3.1 PCR擴(kuò)增37-38
• 2.2.3.2 PCR產(chǎn)物的消化38
• 2.2.3.3 轉(zhuǎn)化38
• 2.2.3.4 其他38
• 2.2.4 pTriEx-mod-1.1 HBV重組載體構(gòu)建38-45
• 2.2.4.1 雙酶切39-40
• 2.2.4.2 膠回收40
• 2.2.4.3 連接40-41
• 2.2.4.4 轉(zhuǎn)化41
• 2.2.4.5 p TriEx+pre S/S陽(yáng)性重組子的篩選41-43
• 2.2.4.6 甘油保菌43
• 2.2.4.7 轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒的提取及濃度測(cè)定43-45
• 2.2.5 pTriEx-mod-1.1 HBV重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞及檢測(cè)分析45-48
• 2.2.5.1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染45-46
• 2.2.5.2 細(xì)胞上清中HBsAg及HBV DNA絕對(duì)定量檢測(cè)46-47
• 2.2.5.3 細(xì)胞內(nèi)中間復(fù)制體提取及絕對(duì)定量47-48
• 2.2.6 pcDNA3.1/myc-His(-) A+S基因重組載體構(gòu)建48-52
• 2.2.6.1 PCR擴(kuò)增HBV S區(qū)基因49-50
• 2.2.6.2 PCR產(chǎn)物純化50
• 2.2.6.3 雙酶切及膠回收純化50-51
• 2.2.6.4 連接51
• 2.2.6.5 轉(zhuǎn)化51
• 2.2.6.6 陽(yáng)性重組子的篩選51
• 2.2.6.7 甘油保菌51
• 2.2.6.8 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的提取及濃度測(cè)定51-52
• 2.2.7 pc DNA3.1/myc-His(-) A+S基因重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞及檢測(cè)分析52-56
• 2.2.7.1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染52
• 2.2.7.2 蛋白定量52-53
• 2.2.7.3 Western Blotting檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HBV S融合蛋白表達(dá)53-55
• 2.2.7.4 HBV S融合蛋白的去糖基化55-56
• 2.2.7.5 免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HBV S融合蛋白表達(dá)56
• 2.3 結(jié)果56-65
• 2.3.1 pEASY-T+preS/S克隆構(gòu)建及序列分析結(jié)果56-58
• 2.3.2 定點(diǎn)突變結(jié)果58-59
• 2.3.3 p Tri Ex+pre S/S重組質(zhì)粒構(gòu)建及檢測(cè)結(jié)果59-62
• 2.3.3.1 p TriEx+pre S/S重組質(zhì)粒構(gòu)建59-60
• 2.3.3.2 細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制中間體與培養(yǎng)上清HBV DNA定量檢測(cè)60-61
• 2.3.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg定量61-62
• 2.3.4 pcDNA3.1/myc-His(-) A+HBV S基因重組質(zhì)粒構(gòu)建與檢測(cè)62-65
• 2.3.4.1 pcDNA3.1 真核表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建62-63
• 2.3.4.2 HBV S區(qū)融合蛋白的Western Blotting分析63-64
• 2.3.4.3 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果64-65
• 2.4 結(jié)論65-66
• 2.5 討論66-69
• 第三部分 總結(jié)論69-70
• 參考文獻(xiàn)70-76
• 附錄（綜述）76-89
• 參考文獻(xiàn)84-89
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄89-90
• 致謝90-92

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本文編號(hào)：875476