本文關(guān)鍵詞：HBsAg和抗HBs雙陽性患者S基因新增N-糖基化突變的臨床意義分析

  更多相關(guān)文章： 乙型肝炎病毒 S基因 突變 復(fù)制力 抗原性

【摘要】：目的:分析HBV(Hepatitis B virus,HBV)HBsAg+抗HBs雙陽性患者S基因主要親水區(qū)(major hydrophilic region,MHR)新增N-糖基化突變特點,揭示HBsAg+抗HBs雙陽性的發(fā)生機制和臨床意義。方法:對284例HBsAg+抗HBs雙陽性和314例HBsAg單陽性乙型肝炎病毒感染者S基因擴增及測序分析。對1例攜有MHR區(qū)雙N-糖基化新型突變株的慢性乙肝患者血清樣本進行隨訪收集和深入研究,對HBV前S/S基因進行擴增和克隆測序,觀察新增雙N-糖基化突變的演變過程。構(gòu)建pcDNA3.1(-)-myc-His A和pTriEx-mod-1.1HBV野生株、2種臨床變異株和定點回復(fù)突變株重組質(zhì)粒,瞬時轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細胞,采用實時熒光定量PCR法檢測細胞培養(yǎng)上清中HBV DNA和細胞內(nèi)復(fù)制中間體水平,分析突變對病毒復(fù)制力和分泌能力的影響,并對細胞培養(yǎng)上清中HBs Ag進行絕對定量,同時采用Western blotting和免疫熒光技術(shù)對HBsAg-His融合蛋白進行檢測,分析突變對病毒抗原性的影響。結(jié)果:284例HBsAg+抗HBs雙陽性患者中MHR區(qū)新增N-糖基化突變的檢出率為11.3%(32/284),顯著高于314例HBsAg單陽性患者的2.9%(9/314)(P0.01)。284例HBsAg+抗HBs雙陽性患者中72例為肝細胞癌(Hepatocellμlar carcinoma,HCC),在HBsAg+抗HBs雙陽性伴新增N-糖基化突變者中檢出率為46.9%(15/32),顯著高于HBsAg+抗HBs雙陽性未伴新增N-糖基化突變的22.6%(57/252)(P0.01)。從1例患者中檢出的新型株突變形式為s116-118TST→NST+s131-133TSM→NST,并聯(lián)合sP120缺失+G145D突變,在3份隨訪樣本中該突變株分別占98.0%、2.0%和2.5%,在第2份樣本中檢出s130-132GTS→NSS單N-糖基化突變株,占17.6%,但無sP120缺失+G145D聯(lián)合突變。與野生株相比,新型突變株復(fù)制力提高31%,但HBsAg定量降低。免疫熒光結(jié)果顯示,雙N-糖基化定點回復(fù)突變株可部分恢復(fù)HBsAg檢出水平,提示除雙N-糖基化突變外,s P120缺失+G145D聯(lián)合突變對HBsAg抗原性減弱也有明顯影響。結(jié)論:HBV S基因MHR區(qū)新增N-糖基化突變與HBsAg+抗HBs雙陽性相關(guān),兩者同時出現(xiàn)可能是HCC發(fā)生的高風(fēng)險因素;S基因MHR區(qū)新增雙N-糖基化+sP120缺失+sG145D聯(lián)合突變共同影響HBsAg抗原性。
【關(guān)鍵詞】：乙型肝炎病毒 S基因 突變 復(fù)制力 抗原性
【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R512.62
【目錄】：

• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 英漢縮略詞對照表13-15
• 前言15-17
• 第一部分 臨床樣本篩查分析HBV S基因新增N-糖基化突變17-26
• 1.1 實驗材料與儀器17-18
• 1.1.1 研究對象17
• 1.1.2 主要實驗試劑17-18
• 1.1.3 主要儀器18
• 1.2 實驗方法18-22
• 1.2.1 血清中HBV DNA的提取18-19
• 1.2.2 巢式PCR擴增HBV S區(qū)序列19-22
• 1.2.2.1 第一輪PCR擴增19-20
• 1.2.2.2 PCR產(chǎn)物電泳檢測20
• 1.2.2.3 第2輪PCR擴增20-22
• 1.2.2.4 PCR產(chǎn)物的電泳檢測22
• 1.2.3 測序及分析22
• 1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法22
• 1.3 結(jié)果22-23
• 1.3.1 巢式PCR擴增結(jié)果22-23
• 1.3.2 HBV S區(qū)基因新增N-糖基化突變臨床數(shù)據(jù)分析結(jié)果23
• 1.4 結(jié)論23-24
• 1.5 討論24-26
• 第二部分 HBsAg+抗HBs雙陽性伴S區(qū)新增雙N-糖基化突變臨床意義分析的實驗研究26-69
• 2.1 實驗材料與儀器26-29
• 2.1.1 主要實驗儀器26
• 2.1.2 主要試劑26-28
• 2.1.3 研究對象28-29
• 2.2 實驗方法29-56
• 2.2.1 巢式PCR擴增HBV前S/S序列29-31
• 2.2.1.1 巢式第1輪PCR擴增29-30
• 2.2.1.2 第2輪PCR擴增30-31
• 2.2.1.3 PCR產(chǎn)物的檢測31
• 2.2.2 HBV前S/S區(qū)序列的克隆及測序分析31-36
• 2.2.2.1 PCR產(chǎn)物純化32
• 2.2.2.2 PCR產(chǎn)物末端加A32-33
• 2.2.2.3 與T載體連接33
• 2.2.2.4 轉(zhuǎn)化33-34
• 2.2.2.5 挑菌及搖菌34
• 2.2.2.6 菌液PCR34-35
• 2.2.2.7 PCR產(chǎn)物電泳檢測35
• 2.2.2.8 測序分析35-36
• 2.2.2.9 小提質(zhì)粒36
• 2.2.3 定點突變36-38
• 2.2.3.1 PCR擴增37-38
• 2.2.3.2 PCR產(chǎn)物的消化38
• 2.2.3.3 轉(zhuǎn)化38
• 2.2.3.4 其他38
• 2.2.4 pTriEx-mod-1.1 HBV重組載體構(gòu)建38-45
• 2.2.4.1 雙酶切39-40
• 2.2.4.2 膠回收40
• 2.2.4.3 連接40-41
• 2.2.4.4 轉(zhuǎn)化41
• 2.2.4.5 p TriEx+pre S/S陽性重組子的篩選41-43
• 2.2.4.6 甘油保菌43
• 2.2.4.7 轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒的提取及濃度測定43-45
• 2.2.5 pTriEx-mod-1.1 HBV重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染細胞及檢測分析45-48
• 2.2.5.1 瞬時轉(zhuǎn)染45-46
• 2.2.5.2 細胞上清中HBsAg及HBV DNA絕對定量檢測46-47
• 2.2.5.3 細胞內(nèi)中間復(fù)制體提取及絕對定量47-48
• 2.2.6 pcDNA3.1/myc-His(-) A+S基因重組載體構(gòu)建48-52
• 2.2.6.1 PCR擴增HBV S區(qū)基因49-50
• 2.2.6.2 PCR產(chǎn)物純化50
• 2.2.6.3 雙酶切及膠回收純化50-51
• 2.2.6.4 連接51
• 2.2.6.5 轉(zhuǎn)化51
• 2.2.6.6 陽性重組子的篩選51
• 2.2.6.7 甘油保菌51
• 2.2.6.8 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的提取及濃度測定51-52
• 2.2.7 pc DNA3.1/myc-His(-) A+S基因重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染細胞及檢測分析52-56
• 2.2.7.1 瞬時轉(zhuǎn)染52
• 2.2.7.2 蛋白定量52-53
• 2.2.7.3 Western Blotting檢測細胞內(nèi)HBV S融合蛋白表達53-55
• 2.2.7.4 HBV S融合蛋白的去糖基化55-56
• 2.2.7.5 免疫熒光檢測細胞內(nèi)HBV S融合蛋白表達56
• 2.3 結(jié)果56-65
• 2.3.1 pEASY-T+preS/S克隆構(gòu)建及序列分析結(jié)果56-58
• 2.3.2 定點突變結(jié)果58-59
• 2.3.3 p Tri Ex+pre S/S重組質(zhì)粒構(gòu)建及檢測結(jié)果59-62
• 2.3.3.1 p TriEx+pre S/S重組質(zhì)粒構(gòu)建59-60
• 2.3.3.2 細胞內(nèi)HBV復(fù)制中間體與培養(yǎng)上清HBV DNA定量檢測60-61
• 2.3.3.3 細胞培養(yǎng)上清中HBsAg定量61-62
• 2.3.4 pcDNA3.1/myc-His(-) A+HBV S基因重組質(zhì)粒構(gòu)建與檢測62-65
• 2.3.4.1 pcDNA3.1 真核表達重組質(zhì)粒構(gòu)建62-63
• 2.3.4.2 HBV S區(qū)融合蛋白的Western Blotting分析63-64
• 2.3.4.3 免疫熒光檢測結(jié)果64-65
• 2.4 結(jié)論65-66
• 2.5 討論66-69
• 第三部分 總結(jié)論69-70
• 參考文獻70-76
• 附錄（綜述）76-89
• 參考文獻84-89
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄89-90
• 致謝90-92

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳士林;廖穎之;;54例HBsAg和HBeAg雙陽性產(chǎn)婦一年隨訪觀察[J];廣東衛(wèi)生防疫資料;1986年02期

2 王素美;;“兩對半”是雙陽性,影響胎兒嗎?[J];父母必讀;1999年04期

3 周正菊;雷鴻斌;龍聰;;血清HBsAg、抗-HBs雙陽性結(jié)果的初步分析[J];國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志;2012年04期

4 朱晶;張欣欣;;9例乙型肝炎病毒免疫逃避株氨基酸序列分析[J];中國輸血雜志;2013年09期

5 王兵;對HIV-1/2雙陽性血清樣本的判斷[J];國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;1995年01期

6 王強;周筱瓊;于小妹;王麗君;;一例成年男性CD19與CD16+56雙陽性淋巴細胞的報道[J];檢驗醫(yī)學(xué);2010年01期

7 王永忠,趙紅霞,周國平,周志武,陳敏,陳春華;乙肝病毒E抗原和抗體雙陽性者中病毒X及前C基因變異熱點研究[J];江西醫(yī)學(xué)檢驗;2002年05期

8 陶洪群,葉薇;乙肝病毒血清學(xué)檢測中s系統(tǒng)和e系統(tǒng)雙陽性的分析[J];臨床檢驗雜志;2003年S1期

9 肖娟,武永吉,張之南,呂照江,陳實平,董紅燕;磁珠雙陽性分選法在陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥患者骨髓CD34~+CD59~+細胞體外擴增的應(yīng)用[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2003年02期

10 朱浩穩(wěn);任碧瓊;周志虹;;乙型肝炎表面抗原和抗體雙陽性模式淺析[J];細胞與分子免疫學(xué)雜志;2006年02期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 馬麗娜;丁向春;張栩;;HBeAg、HBeAb雙陽性慢性乙型肝炎臨床分析[A];第五屆全國肝臟疾病臨床暨中華肝臟病雜志成立十周年學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

2 許艷麗;杜慶華;;淺析流式細胞免疫分型中的CD19、CD10雙陽性群體[A];第11次中國實驗血液學(xué)會議論文匯編[C];2007年

3 王永忠;吳國祥;趙紅霞;周國平;陳敏;陳春華;;HBeAg／抗-HBe雙陽性患者血清病毒基因變異研究[A];第五屆全國肝臟疾病臨床暨中華肝臟病雜志成立十周年學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

4 黃維金;方鑫;周誠;辜文潔;吳星;張瑞;吳曉音;朱鳳才;曾瀅;王佑春;梁爭論;魯鳳民;;HBsAg和抗-HBs雙陽性無癥狀乙肝攜帶者HBV S基因序列分析[A];第五次全國免疫診斷暨疫苗學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2011年

5 肖錫賓;張昌卿;張峰;李經(jīng)略;馮凱濤;孫韻;葉永照;;“雙陽性標(biāo)準(zhǔn)”在鼻咽癌血清學(xué)篩查中的應(yīng)用[A];2000全國腫瘤學(xué)術(shù)大會論文集[C];2000年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 盧姍姍;HBsAg和抗HBs雙陽性患者S基因新增N-糖基化突變的臨床意義分析[D];桂林醫(yī)學(xué)院;2016年

2 張健;干擾素相關(guān)的HBeAg/抗-HBe同時陽性的臨床特征及可能機制[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

，

本文編號：875476