本文關(guān)鍵詞：脂肪酸體外通過誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制HBV復(fù)制及HBsAg分泌

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【摘要】：目的:乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染合并非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)越來越多見,然而脂肪性肝病對(duì)HBV復(fù)制和相關(guān)抗原分泌的影響及其機(jī)制目前不清楚。肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)是參與多種肝臟疾病中常見的病理生理過程。為了解脂肪性肝病對(duì)HBV DNA復(fù)制及HBsAg分泌的影響,本研究通過建立慢性HBV感染合并脂肪性肝病細(xì)胞模型,初步探討脂肪酸對(duì)HBV復(fù)制的影響及其機(jī)制。方法:以HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15細(xì)胞為研究對(duì)象,用硬脂酸(stearic acid,SA)、油酸(oleic acid,OA)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生脂肪變性,應(yīng)用MTS法檢測SA、OA對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響,應(yīng)用油紅O-蘇木精染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況,GPO-PAP法檢測細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(triglyceride,TG)含量,確定慢性HBV感染合并脂肪性肝病細(xì)胞模型的建立。應(yīng)用Western Blotting(WB)技術(shù)檢測葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP 78)、真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶(PKR-like ER kinase,PERK)、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein 1c,SREBP1c)的表達(dá)及磷酸化水平來判斷細(xì)胞ER stress;應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測培養(yǎng)上清HBV DNA載量、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清HBsAg、HBeAg水平來判斷HBV復(fù)制水平。進(jìn)一步分別用4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,PBA)及GRP78小干擾RNA(small interfering RNA,GRP78 siRNA)減輕ER stress及阻斷GRP78表達(dá),觀察脂肪酸對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBV復(fù)制的影響。結(jié)果:1、SA和OA誘導(dǎo)HepG2.2.15細(xì)胞發(fā)生脂肪變性。100μM SA及0.2mM OA分別作用于HepG2.2.15細(xì)胞后,隨著時(shí)間的延長,細(xì)胞內(nèi)脂滴增多增大,并出現(xiàn)融合現(xiàn)象;細(xì)胞內(nèi)TG的合成也顯著增加。成功構(gòu)建了慢性HBV感染合并脂肪性肝病細(xì)胞模型。2、SA和OA誘導(dǎo)HepG2.2.15細(xì)胞ER stress。用50μM、100μM、200μM SA及0.1mM、0.2mM、0.4mM OA分別作用于HepG2.2.15細(xì)胞48h后,GRP 78表達(dá)均顯著增加;100μM SA及0.2mM OA作用于HepG2.2.15細(xì)胞后,GRP 78表達(dá)水平、PERK及eIF2α磷酸化水平、SREBP1c表達(dá)水平從24h至72h時(shí)間依賴性增加。以上結(jié)果證實(shí)SA及OA時(shí)間及濃度依賴性誘導(dǎo)HepG2.2.15細(xì)胞ER stress。3、SA和OA抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg分泌。50μM、100μM、200μM SA及0.1mM、0.2mM、0.4mM OA在48h濃度依賴性抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg分泌;200μM SA時(shí)顯著抑制HBeAg分泌;100μM SA和0.2mM OA分別作用于HepG2.2.15細(xì)胞24h至72h后,細(xì)胞外HBsAg分泌顯著降低,HBeAg分泌也有下降但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果證實(shí)SA及OA時(shí)間及濃度依賴性抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg分泌。4、SA和OA抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA復(fù)制。50μM、100μM、200μM SA及0.1mM、0.2mM、0.4mM OA作用于HepG2.2.15細(xì)胞48h,細(xì)胞外HBV DNA水平濃度依賴性降低;100μM SA和0.2mM OA分別作用于HepG2.2.15細(xì)胞后,從24h至72h細(xì)胞外HBV DNA水平顯著降低。以上結(jié)果證實(shí)SA及OA時(shí)間及濃度依賴性抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA復(fù)制。5、脂肪酸體外通過誘導(dǎo)ER stress抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg分泌和HBV DNA復(fù)制。用PBA減輕SA和OA誘導(dǎo)的HepG2.2.15細(xì)胞ER stress后,HBsAg分泌及HBV DNA復(fù)制水平顯著增加。以上結(jié)果說明脂肪酸通過誘導(dǎo)HepG2.2.15細(xì)胞ER stress抑制HBV復(fù)制及HBsAg分泌。6、GRP78 siRNA對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBV復(fù)制的影響。首先發(fā)現(xiàn)GRP78 siRNA顯著抑制SA誘導(dǎo)的GRP78表達(dá),但我們觀察到用GRP78 siRNA抑制GRP78表達(dá)后,SA對(duì)HBsAg分泌及HBV DNA的抑制作用并未減輕,說明脂肪酸可能并不通過誘導(dǎo)GRP78表達(dá)抑制HBsAg的分泌和HBV DNA復(fù)制。結(jié)論:脂肪酸體外通過誘導(dǎo)肝細(xì)胞ER stress抑制HBsAg分泌和HBV DNA復(fù)制,初步結(jié)果表明這種抑制作用可能不是通過誘導(dǎo)GRP78表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 HepG2.2.15細(xì)胞 硬脂酸 油酸 非酒精性脂肪性肝病 HBV DNA HBsAg GRP78
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.62;R575
【目錄】：

• 中英縮略詞表4-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-13
• 1 材料與方法13-27
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料13-14
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑14-15
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法15-26
• 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法26-27
• 2 結(jié)果27-51
• 2.1 HepG2.2.15 細(xì)胞脂肪變性模型的建立27-31
• 2.2 脂肪酸誘導(dǎo) Hep G2.2.15 細(xì)胞 ER stress31-35
• 2.3 SA 和 OA 對(duì) Hep G2.2.15 細(xì)胞 HBs Ag、HBe Ag 分泌的影響35-40
• 2.4 SA 及 OA 對(duì) Hep G2.2.15 細(xì)胞 HBV DNA 復(fù)制的影響40-42
• 2.5 SA 及 OA 通過誘導(dǎo) Hep G2.2.15 細(xì)胞 ER stress 抑制 HBs Ag、HBe Ag 分泌及 HBVDNA 復(fù)制42-47
• 2.6 GRP 78 si RNA 干預(yù)對(duì) Hep G2.2.15 細(xì)胞 HBV 復(fù)制的影響47-51
• 3 討論51-55
• 4 結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 綜述61-70
• 參考文獻(xiàn)66-70
• 致謝70-71
• 作者簡介71

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本文編號(hào)：838958