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發(fā)布時間：2017-09-09 04:48
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更多相關(guān)文章： 細(xì)胞色素P4502E1 氯美噻唑 Binge drinking 急性酒精性脂肪肝 氧化應(yīng)激 自噬溶酶體途徑
【摘要】：研究目的酒精是一種常見的肝臟毒素,過量的酒精攝入可以導(dǎo)致酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)。ALD是一種逐漸進(jìn)展的肝臟疾病,包括酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver, AFL)、酒精性肝炎、肝纖維化及肝硬化等多種病理學(xué)表型。AFL是ALD早期出現(xiàn)的可逆階段,被視為對ALD進(jìn)行防治的最佳干預(yù)階段。細(xì)胞色素P4502E1(cytochrome P4502E1,CYP2E1)是CYP450超家族的一員,也是微粒體乙醇氧化酶系統(tǒng)(microsomal ethanol-oxidizing system, MEOS)的主要成員；活化的CYP2E1可以產(chǎn)生大量的活性氧(]cactive oxygen species,ROS)。已有研究證實了CYP2E1在慢性AFL發(fā)病中扮演著重要角色,其分子機(jī)制包括過氧化物酶體增殖物活化受體αa(peroxisome proliferator-activated receptor-α, PPAR-α)活性降低等因素。酒精對肝臟的損傷受飲酒劑量和飲酒方式等多種因素的影響。Binge drinking是指短時間內(nèi)攝入大量酒精的飲酒方式,可以導(dǎo)致急性酒精性肝損傷如脂肪肝、肝炎和肝細(xì)胞壞死等。流行病學(xué)資料表明全球范圍內(nèi)binge drinking的發(fā)生率正在逐年增長。以往關(guān)于AFL的研究多集中在慢性AFL,而binge drinking誘導(dǎo)的AFL卻較少地受到關(guān)注。在慢性AFL發(fā)病中起關(guān)鍵作用的CYP2E1是否是導(dǎo)致急性AFL發(fā)病的關(guān)鍵因素?CYP2E1的抑制劑是否能夠拮抗binge drinking導(dǎo)致的急性肝損傷?這些問題仍待解答。本研究擬建立binge drinking誘導(dǎo)的急性AFL小鼠模型,研究CYP2E1特異性抑制劑氯美噻唑(Chlormethiazole, CMZ)對急性AFL的拮抗作用,并從氧化應(yīng)激、線粒體損傷、肝臟脂肪合成分解代謝相關(guān)信號通路等方面進(jìn)行分子機(jī)制探討。研究方法SPF級雄性昆明小鼠(18-22 g)30只,適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后,隨機(jī)分成3組(n=10)：對照組,模型組和CMZ/乙醇組。CMZ/乙醇組和模型組小鼠分別給予CMZ(50 mg/kg bw)和等體積的生理鹽水；2h后兩組小鼠通過灌胃給予3次5 g/kg bw乙醇(25%,w/v,兩次之間間隔12 h)誘導(dǎo)急性AFL。對照組小鼠給予等體積無菌生理鹽水和等熱量／等體積的麥芽糖糊精溶液。末次酒精給予4小時后,摘眼球取血分離血清；隨后處死動物,迅速分離肝臟,稱重后分割成小塊組織,分別用于病理學(xué)檢測、生化指標(biāo)測定、western blotting及qRT-PCR分析。通過HE染色、蘇丹Ⅲ染色、油紅O染色和透射電鏡觀察肝臟組織病理學(xué)變化。通過生化測定試劑盒測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase, ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase, AST)、甘油三酯(triglyceride, TG)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)和血清乙醇的含量；通過ELISA試劑盒測定腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和脂聯(lián)素的含量；通過western blotting和qRT-PCR技術(shù)測定PPAR-α、甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(sterol regulatory element-binding protein-1c, SREBP-lc)、磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)等調(diào)控脂肪代謝的分子蛋白和mRNA水平。研究結(jié)果1.CMZ有效抑制了急性乙醇暴露導(dǎo)致的急性肝損傷：CMZ干預(yù)顯著抑制了急性乙醇暴露導(dǎo)致的血清轉(zhuǎn)氨酶活性的升高,血清和肝臟TG含量的增加。與模型組小鼠相比,CMZ干預(yù)組小鼠血清和肝臟TG含量分別下降了31.86%和52%(P0.05)。病理學(xué)檢查結(jié)果顯示模型組小鼠肝細(xì)胞中有大量脂肪滴蓄積；CMZ干預(yù)組小鼠脂肪滴明顯減少。2.CMZ顯著地抑制了急性乙醇暴露導(dǎo)致的小鼠肝臟中CYP2E1的活化和氧化應(yīng)激：與對照組小鼠相比,模型組小鼠肝臟中CYP2E1的蛋白含量以及肝臟MDA和4-HNE的含量均顯著增加(P0.05); GSH的含量顯著降低(P0.05)。與模型組小鼠相比,CMZ干預(yù)組小鼠肝臟CYP2E1的蛋白含量和MDA的含量分別下降了28.94%和37.46%,GSH的含量增加了73.87%(P0.05)。免疫組化結(jié)果顯示,CMZ干預(yù)顯著地抑制了肝組織中4-HNE的表達(dá)。3.CMZ抑制了急性乙醇暴露導(dǎo)致的線粒體損傷：透射電鏡觀察結(jié)果顯示模型組小鼠肝細(xì)胞中有大量的脂肪滴；同時肝細(xì)胞線粒體發(fā)生了腫脹、破碎、溶解。CMZ干預(yù)顯著地抑制了乙醇導(dǎo)致的肝細(xì)胞中脂肪蓄積和線粒體損傷。4.CMZ和急性乙醇暴露對PPAR-a信號通路相關(guān)分子表達(dá)的影響：與對照組小鼠相比,模型組小鼠肝臟中PPAR-a,乙酰輔酶A氧化酶(acyl-CoA oxidase, ACOX)和脂肪酸結(jié)合蛋白(liver fatty acid-binding protein, LFABP)的mRNA水平分別下降了16.35%,29.39%,和25.97%(P0.05); CMZ干預(yù)有效地抑制了PPAR-α和LFABP mRNA水平的降低(P0.05)。與對照組小鼠相比,模型組小鼠肝臟中PPAR-α,ACOX和LFABP的蛋白水平均顯著增加(P0.05)；CMZ干預(yù)抑制了PPAR-α和LFABP蛋白水平的增加(p0.05)。5.CMZ和急性乙醇暴露對AMPK和乙酰輔酶A羧化酶(acyl-CoA carboxylase, ACC)蛋白水平及其磷酸化水平的影響：與對照組小鼠相比,模型組小鼠肝臟中AMPK、ACC、 p-AMPK、p-ACC的蛋白水平均未發(fā)生顯著性的變化。與模型組小鼠相比,CMZ干預(yù)組小鼠肝臟中p-AMPK和p-ACC的蛋白水平略有下降(P0.05)。6.CMZ干預(yù)對調(diào)控脂肪合成代謝關(guān)鍵分子的影響：SREBP-1c和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)以及二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶2 (diacylglycerol acyltransferase 2, DGAT2)的蛋白水平,以及SREBP-1c和FAS的mRNA水平均未受到CMZ干預(yù)或急性乙醇暴露的影響。7.CMZ和急性乙醇暴露對肝細(xì)胞自噬活性的影響：與對照組小鼠相比,模型組小鼠肝臟的LC3-Ⅱ/LC-I比值顯著增加(P0.05)：p62蛋白水平顯著降低(P0.05)。與模型組小鼠相比,CMZ干預(yù)組小鼠p62的蛋白水平進(jìn)一步下降(P0.05),LC3Ⅱ/LC3I比值也略有下降(P0.05)。8.CMZ和急性乙醇暴露對血清乙醇、TNF-α和脂聯(lián)素含量的影響：CMZ顯著抑制了急性乙醇暴露導(dǎo)致的血清脂聯(lián)素含量的降低；CMZ對血清乙醇含量無顯著影響；CMZ和急性乙醇暴露對血清TNF-α含量未見明顯影響。結(jié)論1.CMZ能夠拮抗急性乙醇暴露導(dǎo)致的小鼠肝內(nèi)脂肪的蓄積。2.CMZ可能通過抑制CYP2E1的活化而減輕急性乙醇暴露誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。3.CMZ對急性AFL的拮抗作用可能與其抑制CYP2E1的活性、激活自噬溶酶體途徑以及增加脂聯(lián)素分泌等因素有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)胞色素P4502E1 氯美噻唑 Binge drinking 急性酒精性脂肪肝 氧化應(yīng)激 自噬溶酶體途徑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575.5
【目錄】： - 摘要6-10
- 英文摘要10-14
- 符號說明14-15
- 前言15-18
- 材料與方法18-30
- 結(jié)果30-39
- 討論39-49
- 結(jié)論49-50
- 參考文獻(xiàn)50-63
- 致謝63-64
- 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄64-65
- 學(xué)位論文評閱及答辯情況表65
【參考文獻(xiàn)】
中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條
1 Susana Llerena;María Teresa Arias-Loste;Angela Puente;Joaquín Cabezas;Javier Crespo;Emilio Fábrega;;Binge drinking: Burden of liver disease and beyond[J];World Journal of Hepatology;2015年27期
2 延華;張粉利;高艷瓊;魯曉嵐;羅金燕;;飲酒與酒精性肝病流行病學(xué)調(diào)查研究[J];陜西醫(yī)學(xué)雜志;2015年07期
3 Elisabetta Ceni;Tommaso Mello;Andrea Galli;;Pathogenesis of alcoholic liver disease:Role of oxidative metabolism[J];World Journal of Gastroenterology;2014年47期
4 賈艷;付怡靜;劉曉陽;楊國慶;;我國酒精性脂肪肝病的研究進(jìn)展[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2014年04期
5 何艷;徐騰達(dá);王厚力;李濤;吉栩;于學(xué)忠;;北京地區(qū)急性酒精中毒發(fā)病規(guī)律研究[J];中國急救醫(yī)學(xué);2011年09期
6 陳士林;孟曉丹;王炳元;向國卿;;遼寧省部分城市酒精性肝病流行現(xiàn)狀調(diào)查[J];實用肝臟病雜志;2010年06期
7 季成葉;;我國大學(xué)生過量飲酒行為流行現(xiàn)狀[J];中國學(xué)校衛(wèi)生;2010年10期
8 Gyongyi Szabo;Shashi Bala;;Alcoholic liver disease and the gut-liver axis[J];World Journal of Gastroenterology;2010年11期
9 延華;魯曉嵐;羅金燕;周小彥;;陜、甘兩省酒精性與非酒精性脂肪肝流行病學(xué)分析[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2007年04期
10 ;Ethanol induced mitochondria injury and permeability transition pore opening: Role of mitochondria in alcoholic liver disease[J];World Journal of Gastroenterology;2007年16期
中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條
1 高海鷹;牛莉;;氯美噻唑概述[A];2010施慧達(dá)杯第十屆全國青年藥學(xué)工作者最新科研成果交流會論文集[C];2010年
，
本文編號：818395
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【摘要】：研究目的酒精是一種常見的肝臟毒素,過量的酒精攝入可以導(dǎo)致酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)。ALD是一種逐漸進(jìn)展的肝臟疾病,包括酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver, AFL)、酒精性肝炎、肝纖維化及肝硬化等多種病理學(xué)表型。AFL是ALD早期出現(xiàn)的可逆階段,被視為對ALD進(jìn)行防治的最佳干預(yù)階段。細(xì)胞色素P4502E1(cytochrome P4502E1,CYP2E1)是CYP450超家族的一員,也是微粒體乙醇氧化酶系統(tǒng)(microsomal ethanol-oxidizing system, MEOS)的主要成員；活化的CYP2E1可以產(chǎn)生大量的活性氧(]cactive oxygen species,ROS)。已有研究證實了CYP2E1在慢性AFL發(fā)病中扮演著重要角色,其分子機(jī)制包括過氧化物酶體增殖物活化受體αa(peroxisome proliferator-activated receptor-α, PPAR-α)活性降低等因素。酒精對肝臟的損傷受飲酒劑量和飲酒方式等多種因素的影響。Binge drinking是指短時間內(nèi)攝入大量酒精的飲酒方式,可以導(dǎo)致急性酒精性肝損傷如脂肪肝、肝炎和肝細(xì)胞壞死等。流行病學(xué)資料表明全球范圍內(nèi)binge drinking的發(fā)生率正在逐年增長。以往關(guān)于AFL的研究多集中在慢性AFL,而binge drinking誘導(dǎo)的AFL卻較少地受到關(guān)注。在慢性AFL發(fā)病中起關(guān)鍵作用的CYP2E1是否是導(dǎo)致急性AFL發(fā)病的關(guān)鍵因素?CYP2E1的抑制劑是否能夠拮抗binge drinking導(dǎo)致的急性肝損傷?這些問題仍待解答。本研究擬建立binge drinking誘導(dǎo)的急性AFL小鼠模型,研究CYP2E1特異性抑制劑氯美噻唑(Chlormethiazole, CMZ)對急性AFL的拮抗作用,并從氧化應(yīng)激、線粒體損傷、肝臟脂肪合成分解代謝相關(guān)信號通路等方面進(jìn)行分子機(jī)制探討。研究方法SPF級雄性昆明小鼠(18-22 g)30只,適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后,隨機(jī)分成3組(n=10)：對照組,模型組和CMZ/乙醇組。CMZ/乙醇組和模型組小鼠分別給予CMZ(50 mg/kg bw)和等體積的生理鹽水；2h后兩組小鼠通過灌胃給予3次5 g/kg bw乙醇(25%,w/v,兩次之間間隔12 h)誘導(dǎo)急性AFL。對照組小鼠給予等體積無菌生理鹽水和等熱量／等體積的麥芽糖糊精溶液。末次酒精給予4小時后,摘眼球取血分離血清；隨后處死動物,迅速分離肝臟,稱重后分割成小塊組織,分別用于病理學(xué)檢測、生化指標(biāo)測定、western blotting及qRT-PCR分析。通過HE染色、蘇丹Ⅲ染色、油紅O染色和透射電鏡觀察肝臟組織病理學(xué)變化。通過生化測定試劑盒測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase, ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase, AST)、甘油三酯(triglyceride, TG)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)和血清乙醇的含量；通過ELISA試劑盒測定腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和脂聯(lián)素的含量；通過western blotting和qRT-PCR技術(shù)測定PPAR-α、甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(sterol regulatory element-binding protein-1c, SREBP-lc)、磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)等調(diào)控脂肪代謝的分子蛋白和mRNA水平。研究結(jié)果1.CMZ有效抑制了急性乙醇暴露導(dǎo)致的急性肝損傷：CMZ干預(yù)顯著抑制了急性乙醇暴露導(dǎo)致的血清轉(zhuǎn)氨酶活性的升高,血清和肝臟TG含量的增加。與模型組小鼠相比,CMZ干預(yù)組小鼠血清和肝臟TG含量分別下降了31.86%和52%(P0.05)。病理學(xué)檢查結(jié)果顯示模型組小鼠肝細(xì)胞中有大量脂肪滴蓄積；CMZ干預(yù)組小鼠脂肪滴明顯減少。2.CMZ顯著地抑制了急性乙醇暴露導(dǎo)致的小鼠肝臟中CYP2E1的活化和氧化應(yīng)激：與對照組小鼠相比,模型組小鼠肝臟中CYP2E1的蛋白含量以及肝臟MDA和4-HNE的含量均顯著增加(P0.05); GSH的含量顯著降低(P0.05)。與模型組小鼠相比,CMZ干預(yù)組小鼠肝臟CYP2E1的蛋白含量和MDA的含量分別下降了28.94%和37.46%,GSH的含量增加了73.87%(P0.05)。免疫組化結(jié)果顯示,CMZ干預(yù)顯著地抑制了肝組織中4-HNE的表達(dá)。3.CMZ抑制了急性乙醇暴露導(dǎo)致的線粒體損傷：透射電鏡觀察結(jié)果顯示模型組小鼠肝細(xì)胞中有大量的脂肪滴；同時肝細(xì)胞線粒體發(fā)生了腫脹、破碎、溶解。CMZ干預(yù)顯著地抑制了乙醇導(dǎo)致的肝細(xì)胞中脂肪蓄積和線粒體損傷。4.CMZ和急性乙醇暴露對PPAR-a信號通路相關(guān)分子表達(dá)的影響：與對照組小鼠相比,模型組小鼠肝臟中PPAR-a,乙酰輔酶A氧化酶(acyl-CoA oxidase, ACOX)和脂肪酸結(jié)合蛋白(liver fatty acid-binding protein, LFABP)的mRNA水平分別下降了16.35%,29.39%,和25.97%(P0.05); CMZ干預(yù)有效地抑制了PPAR-α和LFABP mRNA水平的降低(P0.05)。與對照組小鼠相比,模型組小鼠肝臟中PPAR-α,ACOX和LFABP的蛋白水平均顯著增加(P0.05)；CMZ干預(yù)抑制了PPAR-α和LFABP蛋白水平的增加(p0.05)。5.CMZ和急性乙醇暴露對AMPK和乙酰輔酶A羧化酶(acyl-CoA carboxylase, ACC)蛋白水平及其磷酸化水平的影響：與對照組小鼠相比,模型組小鼠肝臟中AMPK、ACC、 p-AMPK、p-ACC的蛋白水平均未發(fā)生顯著性的變化。與模型組小鼠相比,CMZ干預(yù)組小鼠肝臟中p-AMPK和p-ACC的蛋白水平略有下降(P0.05)。6.CMZ干預(yù)對調(diào)控脂肪合成代謝關(guān)鍵分子的影響：SREBP-1c和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)以及二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶2 (diacylglycerol acyltransferase 2, DGAT2)的蛋白水平,以及SREBP-1c和FAS的mRNA水平均未受到CMZ干預(yù)或急性乙醇暴露的影響。7.CMZ和急性乙醇暴露對肝細(xì)胞自噬活性的影響：與對照組小鼠相比,模型組小鼠肝臟的LC3-Ⅱ/LC-I比值顯著增加(P0.05)：p62蛋白水平顯著降低(P0.05)。與模型組小鼠相比,CMZ干預(yù)組小鼠p62的蛋白水平進(jìn)一步下降(P0.05),LC3Ⅱ/LC3I比值也略有下降(P0.05)。8.CMZ和急性乙醇暴露對血清乙醇、TNF-α和脂聯(lián)素含量的影響：CMZ顯著抑制了急性乙醇暴露導(dǎo)致的血清脂聯(lián)素含量的降低；CMZ對血清乙醇含量無顯著影響；CMZ和急性乙醇暴露對血清TNF-α含量未見明顯影響。結(jié)論1.CMZ能夠拮抗急性乙醇暴露導(dǎo)致的小鼠肝內(nèi)脂肪的蓄積。2.CMZ可能通過抑制CYP2E1的活化而減輕急性乙醇暴露誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。3.CMZ對急性AFL的拮抗作用可能與其抑制CYP2E1的活性、激活自噬溶酶體途徑以及增加脂聯(lián)素分泌等因素有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)胞色素P4502E1 氯美噻唑 Binge drinking 急性酒精性脂肪肝 氧化應(yīng)激 自噬溶酶體途徑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575.5
【目錄】：
- 摘要6-10
- 英文摘要10-14
- 符號說明14-15
- 前言15-18
- 材料與方法18-30
- 結(jié)果30-39
- 討論39-49
- 結(jié)論49-50
- 參考文獻(xiàn)50-63
- 致謝63-64
- 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄64-65
- 學(xué)位論文評閱及答辯情況表65
【參考文獻(xiàn)】
中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條
1 Susana Llerena;María Teresa Arias-Loste;Angela Puente;Joaquín Cabezas;Javier Crespo;Emilio Fábrega;;Binge drinking: Burden of liver disease and beyond[J];World Journal of Hepatology;2015年27期
2 延華;張粉利;高艷瓊;魯曉嵐;羅金燕;;飲酒與酒精性肝病流行病學(xué)調(diào)查研究[J];陜西醫(yī)學(xué)雜志;2015年07期
3 Elisabetta Ceni;Tommaso Mello;Andrea Galli;;Pathogenesis of alcoholic liver disease:Role of oxidative metabolism[J];World Journal of Gastroenterology;2014年47期
4 賈艷;付怡靜;劉曉陽;楊國慶;;我國酒精性脂肪肝病的研究進(jìn)展[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2014年04期
5 何艷;徐騰達(dá);王厚力;李濤;吉栩;于學(xué)忠;;北京地區(qū)急性酒精中毒發(fā)病規(guī)律研究[J];中國急救醫(yī)學(xué);2011年09期
6 陳士林;孟曉丹;王炳元;向國卿;;遼寧省部分城市酒精性肝病流行現(xiàn)狀調(diào)查[J];實用肝臟病雜志;2010年06期
7 季成葉;;我國大學(xué)生過量飲酒行為流行現(xiàn)狀[J];中國學(xué)校衛(wèi)生;2010年10期
8 Gyongyi Szabo;Shashi Bala;;Alcoholic liver disease and the gut-liver axis[J];World Journal of Gastroenterology;2010年11期
9 延華;魯曉嵐;羅金燕;周小彥;;陜、甘兩省酒精性與非酒精性脂肪肝流行病學(xué)分析[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2007年04期
10 ;Ethanol induced mitochondria injury and permeability transition pore opening: Role of mitochondria in alcoholic liver disease[J];World Journal of Gastroenterology;2007年16期
中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條
1 高海鷹;牛莉;;氯美噻唑概述[A];2010施慧達(dá)杯第十屆全國青年藥學(xué)工作者最新科研成果交流會論文集[C];2010年
，本文編號：818395
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