本文關(guān)鍵詞：丙型肝炎病毒調(diào)控外周血單核細(xì)胞中髓源性抑制細(xì)胞的產(chǎn)生及機(jī)制研究

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【摘要】：背景:丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染是全球性的嚴(yán)重的社會(huì)和公共衛(wèi)生問題之一。在急性HCV感染人群中,大約80%將會(huì)發(fā)展成為慢性丙型肝炎,并最終發(fā)展為肝硬化和肝癌。HCV感染的慢性化及其逃避宿主免疫清除的機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。HCV慢性感染與細(xì)胞或體液免疫功能低下或缺失有關(guān),導(dǎo)致機(jī)體不能有效清除病毒,從而形成慢性感染,尤其T細(xì)胞功能異常在HCV慢性感染中發(fā)揮重要的作用。髓源性抑制細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)是骨髓來源的一群異質(zhì)性細(xì)胞,具有抑制T細(xì)胞應(yīng)答的功能。目前關(guān)于MDSCs的研究主要集中在腫瘤,其與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)期預(yù)后有關(guān),而且,MDSCs被認(rèn)為在腫瘤逃避機(jī)體免疫監(jiān)控方面起著重要作用。MDSCs機(jī)制的研究亦集中在其對(duì)T細(xì)胞功能的抑制方面。MDSCs與HCV感染的相關(guān)性研究,僅有很少的文獻(xiàn)報(bào)道,且結(jié)論存在爭議。HCV能否以及如何誘導(dǎo)MDSCs產(chǎn)生尚不完全清楚。因此,本研究擬探討HCV能否從外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中誘導(dǎo)出MDSCs,以及誘導(dǎo)產(chǎn)生的機(jī)制。為HCV感染慢性化機(jī)制的闡明提供重要的理論依據(jù),靶向MDSCs的產(chǎn)生可能開啟一個(gè)治療HCV持續(xù)感染的新手段。目的:1.研究HCV能否從PBMCs中誘導(dǎo)出MDSCs;2.探討HCV調(diào)控MDSCs產(chǎn)生的機(jī)制。內(nèi)容與方法:1.通過免疫磁珠分選等方法從健康供血者外周血濃縮淋巴細(xì)胞中分離出新鮮CD14+PBMCs,HCV核心蛋白(HCV core protein,HCVc)和多聚肌苷酸胞苷酸(polyinosinic:polycytidylic acid,poly I:C)模擬HCV感染并處理CD14+PBMCs。外周血濃縮淋巴細(xì)胞來自長春市中心血站。2.MDSCs的鑒定。用流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)檢測細(xì)胞的表型,實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)來檢測相關(guān)基因的表達(dá)(Arg-1,i NOS,IDO),酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測干擾素γ(Interferon-γ,IFN-γ)的分泌,T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)來檢測T細(xì)胞增殖情況。3.HCV調(diào)控MDSCs產(chǎn)生的機(jī)制研究。用中和抗體(Anti-Human IL-1β,IL-10,TNF-α,IFN-β,IFN-α)和通路抑制劑(PI3-Kinase Inhibitor,PI3Ki)處理CD14+PBMCs。通過FCM、ELISA和RT-PCR來進(jìn)行相關(guān)檢測。結(jié)果:1.HCV對(duì)MDSCs產(chǎn)生的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)作用。HCVc處理的CD14+PBMCs呈現(xiàn)出CD14+HLA-DR-/low表型,上調(diào)IDO表達(dá),并且抑制T細(xì)胞增殖。說明我們成功從PBMCs中誘導(dǎo)出MDSCs。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)poly I:C抑制HCVc對(duì)MDSCs的這種誘導(dǎo)作用。因此,HCV可以調(diào)控PBMCs中MDSCs的產(chǎn)生。2.HCV通過PI3K通路和自分泌細(xì)胞因子來調(diào)控MDSCs的產(chǎn)生。HCVc通過激活PI3K通路誘導(dǎo)IL-10和TNF-α的產(chǎn)生,進(jìn)而促進(jìn)MDSCs的產(chǎn)生。poly I:C通過激活PI3K通路誘導(dǎo)I型干擾素的分泌,從而抑制HCVc所誘導(dǎo)的MDSCs產(chǎn)生。3.IL-10在自分泌細(xì)胞因子中起著核心調(diào)節(jié)作用。HCVc和poly I:C通過激活PI3K通路誘導(dǎo)TNF-α,IL-1β,IL-10和I型干擾素的分泌。在這些細(xì)胞因子中,TNF-α和IL-1β促進(jìn)IL-10的產(chǎn)生,IL-10抑制I型干擾素的分泌,反過來,I型干擾素促進(jìn)IL-10的分泌,IL-10又抑制TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生,從而形成一個(gè)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),IL-10在其中起著核心調(diào)節(jié)作用。結(jié)論:HCVc可以從PBMCs中誘導(dǎo)出MDSCs,但是poly I:C抑制HCVc的這種誘導(dǎo)作用。HCV通過PI3K通路和自分泌細(xì)胞因子來調(diào)控MDSCs的產(chǎn)生,在這些自分泌細(xì)胞因子中IL-10起著核心調(diào)節(jié)作用。
【關(guān)鍵詞】：丙型肝炎病毒 髓源性抑制細(xì)胞 PI3K通路 自分泌細(xì)胞因子 IL-10
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.63
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 中英文縮略詞對(duì)照表11-13
• 第1章 緒論13-15
• 第2章 文獻(xiàn)綜述15-27
• 2.1 MDSCs生物學(xué)特性15-17
• 2.1.1 MDSCs起源15
• 2.1.2 MDSCs亞群和表型15-17
• 2.2 MDSCs免疫抑制機(jī)制17-21
• 2.2.1 Arg-1 和iNOS18
• 2.2.2 氧化應(yīng)激18-19
• 2.2.3 細(xì)胞因子19
• 2.2.4 MDSCs與Tregs19-20
• 2.2.5 MDSCs與NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞20-21
• 2.3 MDSCs擴(kuò)增、活化機(jī)制21-22
• 2.3.1 MDSCs擴(kuò)增機(jī)制21
• 2.3.2 MDSCs活化機(jī)制21-22
• 2.4 MDSCs與病毒感染22-23
• 2.5 MDSCs與HCV23
• 2.6 耗竭M(jìn)DSCs的治療策略23-24
• 2.7 結(jié)語24-27
• 第3章 材料與方法27-39
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料27-29
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑27-28
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備28-29
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)器具29
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法29-37
• 3.2.1 主要試劑配制29-30
• 3.2.2 標(biāo)本來源30
• 3.2.3 PBMCs的分離純化30
• 3.2.4 CD14+細(xì)胞的分離30-31
• 3.2.5 CD4+細(xì)胞的分離31
• 3.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)31
• 3.2.7 細(xì)胞凍存31
• 3.2.8 細(xì)胞復(fù)蘇31
• 3.2.9 流式細(xì)胞術(shù)31-32
• 3.2.10 IFN-α 和IFN-β 的檢測32-33
• 3.2.11 TNF-α、IL-1β 和IL-10的檢測33-34
• 3.2.12 實(shí)時(shí)定量PCR34-37
• 3.2.13 T細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)37
• 3.3 統(tǒng)計(jì)分析37-39
• 第4章 結(jié)果與討論39-59
• 4.1 HCV調(diào)控PBMCs中MDSCs的產(chǎn)生39-48
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-45
• 4.1.2 討論45-47
• 4.1.3 小結(jié)47-48
• 4.2 HCV調(diào)控MDSCs產(chǎn)生的機(jī)制48-53
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-51
• 4.2.2 討論51-52
• 4.2.3 小結(jié)52-53
• 4.3 IL-10在自分泌細(xì)胞因子中起核心調(diào)節(jié)作用53-59
• 4.3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-56
• 4.3.2 討論56-57
• 4.3.3 小結(jié)57-59
• 第5章 結(jié)論59-61
• 本研究的創(chuàng)新與不足61-63
• 參考文獻(xiàn)63-77
• 附錄77-79
• 作者簡介及在學(xué)期間所取得的科研成果79-81
• 致謝81

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