發(fā)布時間：2017-08-12 02:09

  本文關鍵詞：HNF4α抑制非酒精性脂肪性肝炎進展的機制研究

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【摘要】：[研究背景及目的]非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)目前已成為全世界范圍內慢性肝病最主要的原因。其發(fā)病機制與肥胖和胰島素抵抗相關,疾病譜包括單純性非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)、NASH相關的肝纖維化和肝癌。大量研究證實,NASH是NAFLD患者發(fā)展為肝硬化和肝癌的必經(jīng)階段,且NASH與患者死亡率顯著相關。迄今為止,NASH的發(fā)病機制尚未完全清晰,也無公認有效的針對性藥物治療方案。因此研究NASH發(fā)生發(fā)展過程及其機制并找到有效的防治方案具有重要意義。肝細胞核因子 4α(hepatocyte nuclear factor,HNF4α)屬于孤核受體(orphan nuclear receptor,NR),是在肝臟中強勢表達的轉錄因子,對膽汁酸、脂質、葡萄糖和藥物代謝的諸多基因具有關鍵調控作用,在肝細胞分化及維持肝、腸及胰島β細胞的穩(wěn)態(tài)中占有重要地位,是肝細胞重要的標志物。其在肝臟中的靶基因參與葡萄糖[PEPCK基因(PCK1)、L-丙酮酸激酶(L-PK,PKLR)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase,G6PC)]和外源性藥物的代謝(CYP7A1,CYP3A4、CYP2D6等),調控脂質轉運,特別是調控編碼載脂蛋白(APO,APOA2,APOA4、APOB、APOC2,APOC3,和APOC4)相關基因,與膽固醇和甘油三脂代謝密切相關�；贖NF4α在糖脂代謝調控中的關鍵作用,我們認為HNF4α可能用于NASH的治療,成為其新的防治靶點。[實驗方法]一、小鼠NASH進程與HNF4α表達的關系采用蛋氨酸—膽堿缺乏性飲食(MCD)喂養(yǎng)小鼠建立NASH模型,Real-time RT-PCR及Western印跡法檢測喂養(yǎng)不同時間段小鼠肝臟HNF4α表達水平,HE染色、油紅O染色及天狼星紅染色觀察小鼠肝臟病理變化,同時檢測脂代謝相關基因表達及炎癥通路激活情況。二、特異性下調肝臟內HNF4α表達對小鼠NASH進程的影響采用LoxP-Cre系統(tǒng)特異性敲除成年小鼠肝臟內HNF4α,并構建MCD飲食致NASH小鼠模型,研究HNF4α表達下調對小鼠肝臟病理、肝內HNF4α、脂代謝相關基因表達、炎癥通路激活情況、肝臟及血清內甘油三酯(TG)的水平的影響。三、上調肝臟內HNF4α表達水平對小鼠NASH的治療性實驗利用C57BL/6小鼠構建MCD飲食致NASH模型,并以MCS對照飲食小鼠為正常對照,MCD小鼠分別按照2×109efu尾靜脈注射AdHNF4α或AdGFP腺病毒,3w后處死小鼠,Real-time RT-PCR及Western印跡法檢測肝臟HNF4α及脂代謝相關基因表達、炎癥通路激活情況;試劑盒檢測肝臟及血清內甘油三酯(TG)的水平;HE染色、油紅O染色及天狼星紅染色觀察小鼠肝臟病理變化。四、統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)運用SPSS 13軟件進行統(tǒng)計分析,多組間采用One-Way ANOVA分析,配對資料采用配對t檢驗,方差非齊性則采用非參數(shù)檢驗,P0.05為具有顯著性差異。[實驗結果]一、小鼠NASH進程中HNF4α表達逐漸下降1.MCD飼料喂養(yǎng)小鼠2w、4w、6w、8w后,發(fā)現(xiàn)隨著喂養(yǎng)時間增加,MCD組小鼠一般情況明顯變差,體型瘦小,精神狀況差,到8w后出現(xiàn)眼周脫毛現(xiàn)象。Real-time RT-PCR、Western印跡法及病理染色發(fā)現(xiàn)隨著MCD飼料喂養(yǎng)時間增加,HNF4α表達量逐漸降低,肝臟脂質沉積逐漸加重,6周后出現(xiàn)輕微纖維化,8w時HNF4α可下降約80%。2.MCD喂養(yǎng)小鼠后可使小鼠脂肪合成指標如乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl CoA carboxylase,ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、硬脂酞輔酶A去飽和酶(stearoyl-coenzyme A desaturase,SCD-1)、固醇調節(jié)元件結合蛋白-1(sterol regulatory element binding protein-1,SREBP-1)、碳水化合物反應元件結合蛋白(carbohydrate response element binding protein,ChREBP)、氧化物酶體增殖劑激活受體 γ(peroxisome proliferators-activated receptor gamma，，PPARγ)表達下降,此為 MCD飼料特殊性。小鼠肝臟內脂肪分解指標表達明顯下降,肝臟轉運脂肪能力下降,Toll 樣受體(Toll-like receptor 2,TLR2)、TLR4/NF-κB、IL-6/JAK2/STAT3 及TGFβ1/Smad3等炎癥通路被激活。二、特異性下調肝臟內HNF4α表達加快小鼠NASH的發(fā)展1.利用Loxp-Cre系統(tǒng)特異性敲除肝臟內HNF4α使其表達下降后,獲得肝特異性 HNF4α 敲除 HNF4αH-KO 小鼠。MCD 飲食 4w 后,Real-time RT-PCR 及 Western 印跡法檢測發(fā)現(xiàn)HNF4α表達明顯下降,且HNF4αH-KO小鼠較對照組體型瘦小,精神狀況差,肝臟油膩發(fā)黃,邊緣鈍。2.病理改變:與對照組比較,HNF4αH-kO小鼠肝臟肝小葉結構破壞,并見大量脂肪空滴及炎癥細胞浸潤,細胞出現(xiàn)氣球樣變;油紅O染色見較多紅色脂滴,肝臟脂質含量明顯增多,提示HNF4α表達下降后小鼠肝臟脂肪變性加重;天狼星紅染色兩組均未見明顯纖維沉積。3.Real-time RT-PCR及Western印跡法檢測發(fā)現(xiàn)HNF4αH-KO小鼠較對照組脂肪合成指標(ACC、FAS、PPARγ等)明顯增多,肝臟分解脂肪能力下降,且肝臟內TG 含量明顯增多。TLR2、TLR4/NF-κB、IL-6/JAK2/STAT3 及 TGFβ1/Smad3 等炎癥相關基因及通路活性增加。三、上調肝臟內HNF4α表達可減輕小鼠實驗性NASH1.MCD小鼠精神狀態(tài)差,體型瘦弱,眼周毛發(fā)及胡須脫落,肝臟發(fā)黃油膩;經(jīng)尾靜脈注射AdHNF4α腺病毒后,與AdGFP組相比,精神狀態(tài)較好,毛發(fā)及胡須無明顯脫落,肝臟色澤形態(tài)較正常。2.HE染色、油紅O染色及天狼星紅染色顯示AdGFP組小鼠肝臟脂肪變性及炎細胞浸潤嚴重,膠原沉積增多;AdHNF4α治療后小鼠脂肪變性及炎細胞浸潤現(xiàn)象明顯改善,肝臟內脂質含量明顯下降,未觀察到明顯膠原沉積。3.Real-time RT-PCR及Western印跡法檢測脂代謝和炎癥通路相關指標,發(fā)現(xiàn)AdHNF4α治療組HNF4α表達明顯較AdGFP組增多,肝臟分解脂肪能力改善、炎癥相關信號通路基因表達下降。[結論]一、NASH小鼠肝臟內HNF4α表達較正常小鼠明顯下降。二、下調HNF4α表達可加重小鼠NASH進程。三、上調HNF4α表達可減輕小鼠NASH發(fā)展,其機制與改善脂代謝、抑制肝臟炎癥反應有關,HNF4α可能成為NASH治療新靶點。
【關鍵詞】：肝細胞核因子4α(HNF4α) 非酒精性脂肪性肝炎(NASH) 蛋氨酸—膽堿缺乏 性(MCD)飲食
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R575.1
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 中英文縮略詞對照表13-15
• 前言15-17
• 第一部分 小鼠NASH進程與HNF4α表達的關系17-37
• 一、材料19-21
• 二、方法21-28
• 三、結果28-35
• 四、討論35-37
• 第二部分 特異性下調肝臟內HNF4α表達對小鼠NASH的影響37-51
• 一、材料38
• 二、方法38-43
• 三、結果43-49
• 四、討論49-51
• 第三部分 上調肝臟內HNF4α表達對小鼠NASH的治療作用51-62
• 一、材料52
• 二、方法52-55
• 三、結果55-61
• 四、討論61-62
• 全文結論62-63
• 參考文獻63-67
• 綜述67-75
• References72-75
• 在讀期間發(fā)表論文和參與科研75-76
• 致謝76-77

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本文編號：659258