本文關(guān)鍵詞：心理應(yīng)激促進(jìn)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng)的機(jī)制研究

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【摘要】：炎癥性腸病(inflammatory bowel disease IBD)是一類以胃腸道慢性炎癥和粘膜組織損傷為病理特征的疾病,包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis UC)和克羅恩病(Crohn’s disease CD),臨床表現(xiàn)為腹瀉、腹痛和血便,病情常反復(fù)發(fā)作、遷延不愈,主要發(fā)生于歐美國(guó)家。近年來(lái),IBD在亞洲和南美洲的患病率亦日益升高。IBD的病因主要與遺傳、環(huán)境、免疫等因素有關(guān),但腸道慢性炎癥反復(fù)發(fā)作的機(jī)制尚不清楚。部分觀點(diǎn)認(rèn)為,腸道慢性炎癥的發(fā)生與腸道粘膜免疫缺陷有關(guān)。然而,近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)提示,心理應(yīng)激可影響腸道免疫功能,因而與特發(fā)性炎癥性腸道疾病的病理生理機(jī)制密切相關(guān)。應(yīng)激反應(yīng)(stress)是機(jī)體應(yīng)對(duì)周圍環(huán)境變化而產(chǎn)生的主動(dòng)或被動(dòng)的非特異性反應(yīng),包括心理與生理反應(yīng)。當(dāng)受到各種應(yīng)激源(例如冷熱、創(chuàng)傷、感染、手術(shù)、焦慮、抑郁等)刺激時(shí),機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)[交感神經(jīng)系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)]被激活,交感神經(jīng)元和腎上腺髓質(zhì)釋放兒茶酚胺[如腎上腺素(epinephrine,EPI)和去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)],腎上腺皮質(zhì)釋放皮質(zhì)醇。應(yīng)激導(dǎo)致的多種神經(jīng)遞質(zhì)(如兒茶酚胺和血管活性腸肽)的過度釋放,可激活表達(dá)于淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表面的腎上腺素能受體(adrenergic receptor,AR),調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞中細(xì)胞因子和抗體的產(chǎn)生,從而影響局部炎癥反應(yīng)的進(jìn)程。本研究利用葡聚糖硫酸鈉(Dextran Sulfate Sodium,DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型,探討了慢性心理應(yīng)激對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥的影響,研究了應(yīng)激相關(guān)的信號(hào)通路激活促進(jìn)結(jié)腸炎癥反應(yīng)和組織損傷的機(jī)制。主要的研究結(jié)果如下:1.心理應(yīng)激加重DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥及促進(jìn)結(jié)腸組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為探索心理應(yīng)激對(duì)IBD進(jìn)程的影響,我們建立了經(jīng)典的DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型,采用慢性束縛應(yīng)激(chronic restraint stress,CRS)和慢性不可預(yù)見性應(yīng)激(chronic unpredictable stress,CUS)刺激小鼠。我們的研究結(jié)果顯示,CRS和CUS顯著加重了模型小鼠的腸道炎癥,促進(jìn)了結(jié)腸組織中的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及粘膜上皮的損傷,嚴(yán)重破壞了結(jié)腸粘膜的屏障功能,加速了模型小鼠的死亡。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),CUS可促進(jìn)結(jié)腸組織中促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、IL-17A、IL-22)異常表達(dá),導(dǎo)致STAT3炎癥信號(hào)通路過度激活、中性粒細(xì)胞趨化因子(CXCL-1、CXCL-2)表達(dá)水平及外周血中性粒細(xì)胞比例明顯升高、結(jié)腸組織中性粒細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)。2.CUS激活的腎上腺素能信號(hào)在促進(jìn)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用為了探索應(yīng)激相關(guān)的信號(hào)通路在dss誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥中的作用,我們采用β-ar激動(dòng)劑異丙腎上腺素(isoproterenol,iso)處理小鼠,以模擬慢性心理應(yīng)激對(duì)模型動(dòng)物的影響。我們的研究結(jié)果顯示,iso刺激對(duì)dss誘導(dǎo)的小鼠產(chǎn)生了與慢性心理應(yīng)激相似的效應(yīng)。與dss單獨(dú)處理組的小鼠相比,dss+iso誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織損傷更嚴(yán)重,結(jié)腸縮短更明顯,外周血中性粒細(xì)胞比例升高更顯著,結(jié)腸組織中促炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)水平更高,腸粘膜固有層中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度更重。β-ar阻斷劑普萘洛爾可有效抑制由cus引起的炎性因子異常表達(dá)及stat3磷酸化。在細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,用ne刺激ht29細(xì)胞可促進(jìn)cxcl-1和cxcl-2表達(dá)和stat3磷酸化。中性粒細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ne刺激ht29細(xì)胞,可有效地促進(jìn)transwell小室上層的中性粒細(xì)胞向下層的ht29細(xì)胞趨化。我們還發(fā)現(xiàn),兒茶酚胺生物合成的限速酶酪氨酸羥化酶(tyrosinehydroxylase,th)在dss+cus組小鼠結(jié)腸肌層神經(jīng)纖維和神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)顯著升高,表明慢性心理應(yīng)激增強(qiáng)了腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng),提示hpa軸和交感神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間的相互作用在ibd病程中發(fā)揮了重要的作用。3.兒茶酚胺和il-17a協(xié)同激活stat3信號(hào)通路促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)我們發(fā)現(xiàn),應(yīng)激反應(yīng)可增加結(jié)腸組織中il-17a和il-22的表達(dá)。當(dāng)我們用il-17a和ne共同刺激ht29細(xì)胞時(shí),stat3磷酸化程度較ne或il-17a單獨(dú)刺激更加明顯。用ne或iso聯(lián)合il-17a刺激ht29或ct26細(xì)胞時(shí),可見cxcl-1和cxcl-2表達(dá)顯著升高,且明顯高于ne或iso單獨(dú)刺激的效應(yīng)。中性粒細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,單獨(dú)使用ne和il-17a刺激均可產(chǎn)生較強(qiáng)的中性粒細(xì)胞趨化效應(yīng);當(dāng)采用ne和il-17a聯(lián)合刺激細(xì)胞時(shí),可進(jìn)一步促進(jìn)中性粒細(xì)胞的趨化作用。這些結(jié)果提示,在dss誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥過程中,兒茶酚胺和il-17a可協(xié)同調(diào)控中性粒細(xì)胞趨化因子的表達(dá),促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)至結(jié)腸炎癥部位。4.心理應(yīng)激通過激活β1-ar/β2-ar介導(dǎo)的信號(hào)增強(qiáng)dss誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)我們采用了不同的β-ar抑制劑,探索了心理應(yīng)激增強(qiáng)dss誘導(dǎo)的腸道炎癥的信號(hào)機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn),β3-ar特異性阻斷劑sr59230a對(duì)慢性心理應(yīng)激引起的腸道中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和結(jié)腸組織損傷無(wú)明顯的抑制作用。然而,β1-ar/β2-ar抑制劑普萘洛爾則可顯著降低模型小鼠外周血中性粒細(xì)胞的比例,減少結(jié)腸組織中中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn),并對(duì)結(jié)腸組織炎癥反應(yīng)和組織損傷有明顯的改善作用,提示β1-ar/β2-ar介導(dǎo)的信號(hào)通路激活與dss+cus誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān)。普萘洛爾亦可抑制cus誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子和中性粒細(xì)胞趨化因子的表達(dá)上調(diào)及stat3信號(hào)通路的過度活化,表明慢性心理應(yīng)激主要通過活化β1-ar/β2-AR信號(hào)通路促進(jìn)腸道的炎癥反應(yīng)及組織損傷。綜上所述,本研究揭示了慢性心理應(yīng)激促進(jìn)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng)的一個(gè)潛在的重要機(jī)制:慢性心理應(yīng)激導(dǎo)致兒茶酚胺過度釋放,通過激活β腎上腺素能信號(hào),上調(diào)促炎細(xì)胞因子和中性粒細(xì)胞趨化因子的表達(dá),促進(jìn)中性粒細(xì)胞動(dòng)員、招募及浸潤(rùn)至結(jié)腸炎癥部位,加重結(jié)腸炎癥反應(yīng)。我們認(rèn)為,應(yīng)激相關(guān)信號(hào)的激活可能降低結(jié)腸炎癥反應(yīng)的觸發(fā)閾值,誘導(dǎo)結(jié)腸炎癥的反復(fù)發(fā)作,導(dǎo)致結(jié)腸粘膜及其功能的嚴(yán)重?fù)p害。我們的研究結(jié)果為探索心理應(yīng)激與IBD的病理生理機(jī)制的關(guān)系提供了新的思路,亦提示調(diào)控神經(jīng)信號(hào)的藥物可能具有預(yù)防及治療IBD的潛在應(yīng)用價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：心理應(yīng)激 結(jié)腸炎 兒茶酚胺 腎上腺素能受體 中性粒細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R574.62
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-15
• 材料與方法15-27
• （一）材料15-17
• 1 動(dòng)物15
• 2 細(xì)胞株15
• 3 試劑15-16
• 4 抗體16-17
• 5 其他試劑17
• 6 主要儀器17
• 7 其他器材17
• （二）實(shí)驗(yàn)方法17-27
• 1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)17-19
• 2 細(xì)胞培養(yǎng)19
• 3 Western blot19-20
• 4 實(shí)時(shí)定量PCR20-23
• 4.1 RNA提取20-21
• 4.2 反轉(zhuǎn)錄21
• 4.3 實(shí)時(shí)定量PCR21-23
• 5 組織病理23
• 6 免疫組化23-24
• 7 流式細(xì)胞術(shù)24
• 8 小鼠腸道菌群移位的檢測(cè)24-25
• 9 中性粒細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)25
• 10 ELISA25-26
• 11 數(shù)據(jù)分析26-27
• 結(jié)果27-57
• （一）心理應(yīng)激加重DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥27-32
• （二）心理應(yīng)激促進(jìn)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)32-36
• （三）心理應(yīng)激增強(qiáng)DSS誘導(dǎo)的炎性信號(hào)通路活化36-40
• （四）兒茶酚胺在心理應(yīng)激誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)中發(fā)揮重要作用40-46
• （五）兒茶酚胺增強(qiáng)IL-17A誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)46-48
• （六）心理應(yīng)激通過激活 β1-AR/β2-AR促進(jìn)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng)48-57
• 討論57-59
• 參考文獻(xiàn)59-63
• 碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文63-64
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷64-65
• 致謝65

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本文編號(hào)：617471