本文關鍵詞：高通量測序技術用于丙型肝炎病毒感染溯源調查

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【摘要】：背景近年來我國的丙型肝炎聚集性疫情暴發(fā)事件時有發(fā)生。為了調查疫情暴發(fā)的源頭、追蹤傳播關系,有針對性地制定預防控制方案,需要可靠的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)感染溯源實驗室檢測數據提供支持。國外報道用于HCV感染溯源調查的實驗室技術主要有巢式PCR產物直接測序法、PCR產物克隆測序法和終點有限稀釋PCR產物測序法,其中巢式PCR產物直接測序法國內也有報道。巢式PCR產物直接測序法操作簡便,但獲得的信息量少,只能獲得優(yōu)勢準種的核酸序列；而后兩種方法可用于在準種水平上分析HCV感染者之間的傳播關系,不足之處是操作比較繁瑣、工作量大。第二代測序技術(Next-generation sequencing technology. NGS)的核心思想是邊合成邊測序(Sequencing by Synthesis),即通過識別新合成的序列末端的標識來確定DNA的序列,一次檢測可以獲得大量的核酸信息。目前應用較多的技術平臺主要包括Illumina/Solexa Genome Analyzer(美國Illumina公司)、Applied Biosystems SOLID system (美國ABI公司)和Roche 454 FLX焦磷酸測序平臺(美國454 Life Sciences公司)。其中Roche 454 FLX焦磷酸測序平臺曾被用于未經過HCV抗病毒治療的感染者病毒準種的變異性、HCV抗病毒治療患者準種的變異性、HCV急性感染者病毒進化的瓶頸效應、HCV暴發(fā)調查等的研究中,但它因測序成本很高,用于HCV感染溯源調查的實用價值不大。本課題組曾將美國Illumina公司的Miseq高通量測序平臺成功地用于腎透析人群HCV的傳播關系調查。本研究擬利用美國Illumina公司開發(fā)、通量更高的Hiseq高通量測序平臺(簡稱Hiseq測序),建立基于準種分析的HCV感染溯源技術,并嘗試用于靜脈注射吸毒人群中HCV的傳播關系調查,為今后應對丙型肝炎聚集性疫情暴發(fā)調查提供技術儲備。目的1.建立并優(yōu)化基于HCV準種分析的Hiseq測序技術；2.了解靜脈注射吸毒人群中HCV感染者體內HCV準種的分布規(guī)律；3.探索Hiseq測序技術在HCV感染溯源調查中的應用。材料和方法1.研究對象1.1一例新近HCV感染者的溯源調查針對1例2015年1月15日在美沙酮門診發(fā)現的HCV抗體陽轉靜脈注射吸毒者(編號P1),調查在其可能感染HCV的時期內(2014年3月24日之后)與其共用針具、HCV抗體陽性的4例靜脈注射吸毒者(編號P2-P5)的流行病學信息,并以與P1在同一美沙酮門診服藥或者居住在同一鄉(xiāng)鎮(zhèn)、HCV抗體陽性的28例靜脈注射吸毒者(編號C1-C28)作為研究對照。分別采集上述33人的全血樣品5 m1,離心后分離出血漿備用。1.2兩個美沙酮門診靜脈注射吸毒HCV感染者間的傳播關系研究針對2個美沙酮門診H和L,收集2015年1-9月發(fā)現的所有靜脈注射吸毒HCV抗體陽性者的血漿樣品備用(編號分別為H1-H13、L1～L32)。2.實驗方法2.1從血漿樣品中提取RNA,然后逆轉錄合成cDNA。2.2 PCR產物直接測序：分別對NS5B基因區(qū)和Core/E1基因區(qū)進行PCR擴增,產物直接測序；根據序列結果對HCV樣品進行基因亞型分析。2.3針對HCV HVR1區(qū)設計引物、優(yōu)化反應條件。引物盡可能覆蓋多種基因亞型,必要時設計多套引物。2.4針對HCV HVR1區(qū),對cDNA進行PCR擴增；PCR產物純化后,構建DNA文庫,然后進行Hiseq測序。2.5 Hiseq測序數據初步處理后,統(tǒng)計每條獨特序列出現的頻數,了解HCV準種群分布情況；剔除重復序列后,獲得每個樣品的多個獨特準種群序列,進行系統(tǒng)進化分析。結果1.一例新近HCV感染者的溯源調查1.1 HCV基因亞型：P1-P5與28份對照樣品中有11份樣品(P3和10份對照)HCV核酸檢測為陰性,其余樣品核酸檢測為陽性,并獲得了HCV基因亞型分析結果。P1和P2均為3b基因亞型,P4、P5分別為3a、6n基因亞型,據此可以排除P4、P5與P1之間存在傳播關系的可能性。在18份核酸陽性樣品中,8份(C7、C12、C14、C15、C16、C19、C20、C28)的基因亞型與P1相同。1.2 HCV準種群分布：在基因亞型為3b的10份樣品中,9份(P1、P2、C7、 C12、C14、C15、C16、C19、C28) PCR擴增成功并進行Hiseq測序。Hiseq測序結果經初步處理后,9份樣品分別得到了約百萬條核酸序列,獲得的有效序列數為249 753～1086 333條(平均869 608條)。剔除重復序列后,獲得了3-172個(平均48個)獨特準種群的序列。統(tǒng)計每份樣品中各準種群序列出現的頻率并由高到低依次排序,頻數最大(最優(yōu)勢)的前2條序列的頻數之和占該樣品所有準種群總序列的比例都超過了38%,其中4份樣品(C7、C15、C19、C28)超過了85%,有3份樣品(C7、C19、C28)甚至超過了97%。1.3基因離散率：9份樣品的樣品內平均基因離散率為0.5%-13.2%,其中P1、C7、C16的均大于6%,樣品內平均基因離散率的大小與HCV感染時間長短沒有相關性。9份樣品的樣品間平均基因離散率為10.8%～25.0%,P1和P2間平均基因離散率為19.0%,與P1和其余7份樣品間的基因離散率差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。1.4系統(tǒng)進化樹分析：從HCV序列數據庫下載25條HCV 3b亞型參考株序列,與9份樣品的準種群序列一起進行系統(tǒng)進化樹分析。結果顯示,P2、C12、C14、C15、C16、C19、C28的準種群各自聚集為一簇；C7的部分準種群和P1聚集為一簇,其余準種群單獨聚集為一簇。和P1聚集在一簇的那部分C7準種群和P1間的平均基因離散率為6.4%(0～13.3%),這與P1和其余7份樣品間基因離散率的差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。系統(tǒng)進化分析結果提示P1和C7間可能存在直接或間接的HCV傳播關系。鑒于HCV可能存在多重感染的特點,在HCV傳播關系的調查中樣品間基因離散率的最小值這一指標比樣品間平均基因離散率更有價值。2.兩個美沙酮門診靜脈注射吸毒HCV感染者間的傳播關系研究2.1 HCV基因亞型：美沙酮門診H和L共有13份樣品HCV核酸檢測為陰性,其余樣品核酸檢測為陽性,并獲得了HCV基因亞型分析結果。美沙酮門診H有2份樣品(H8、H12) HCV核酸檢測為陰性；在11份核酸陽性樣品中,1份(H1 1)為3a/3b基因亞型；7份H1、H3、H4、H7、H9、H10、H13)為3b基因亞型,2份(H5、H6)為6a基因亞型,1份(H2)為6u基因亞型。美沙酮門診L有11份樣品(L3、L5、L6、L7、L11、L15、L17、L20、L25、L29、 L32) HCV核酸檢測為陰性；在21份核酸陽性樣品中,5份(L8、L18、L21、 L28、L31)為1a基因亞型；1份(L14)為3a/3b基因亞型；6份(L1、L10、L12、L13、L16、L24)為3b基因亞型；1份(L19)為6m/6n基因亞型；4份(L4、L22、L23、L30)為6n基因亞型；其余4份L9、L26、L27)分別為6a、1b、6u、3a基因亞型。1b基因亞型只有1份樣品,可以排除該HCV感染者與其他感染者間存在傳播關系的可能性。2.2 HCV準種群分布：對上述基因亞型分析成功且同一基因亞型不少于2份的所有樣品(共31份)進行HVR1區(qū)PCR擴增,結果有27份樣品擴增成功并進行Hiseq測序。Hiseq測序結果經初步處理后,27份樣品分別獲得的有效序列數為366980～2732511條(平均1432153條)。剔除重復序列后,分別獲得2-207個(平均45個)獨特準種群的序列。統(tǒng)計每份樣品中各準種群序列出現的頻率并由高到低依次排序,頻數最大(最優(yōu)勢)的前2條序列占所有準種群總序列的比例均超過了16%,其中12份樣品(H1、H3、H4、H6、H9、H11、H13、 L1、L8、L16、L18、L31)超過了82%,甚至有8份樣品(H3、H4、H6、H9, L1、L16、L18、L31)超過了96%。2.3基因離散率：27份樣品的樣品內平均基因離散率為0.4%～26.0%,其中H2、H6、H9、L14、L19、L23、L28、L30的均大于5%。大部分樣品之間的最小基因離散率均大于5%,部分樣品之間的基因離散率最小值為0,樣品H6和H9之間的基因離散率最小值為0.4%,H11和L23、L30之間的基因離散率最小值均為0.4%,L8和L21之間的樣品基因離散率最小值為1.9%,L21和L28之間的基因離散率最小值為4.8%。2.4系統(tǒng)進化分析：樣品L28、L31的準種群序列各自單獨聚集為一簇,樣品L8、L18、L21的所有準種群序列和L23、L30的部分準種群序列聚集為一簇；L8和L21之間的基因離散率最小值為1.9%,樣品L8和L23、L18和L23、L18和L30、L21和L23、L21和L30之間的平均基因離散率最小值均為0。樣品H6的部分準種群序列和H9的準種群序列聚集在一起,H6和H9之間的基因離散率最小值為0.4%。樣品H3、L10、L12、L14的準種群序列各自聚集為一簇,樣品H1、H4、H9、H10、H11、H13、L1分別和L23、L30的部分準種群序列聚集在一起,L24和L23的部分準種群序列聚在一起,H11和L23、L30之間的平均基因離散率最小值均為0.4%,L24和L23之間的平均基因離散率最小值為0,其余樣品和L23、L30之間的平均基因離散率最小值均為0,系統(tǒng)進化樹與基因離散率的結果共同提示同一門診內部分感染者之間以及2個門診部分感染者之間均可能存在直接或間接的HCV傳播關系。結論1.本研究建立了基于HCV準種分析的Hiseq測序技術。2.靜脈注射吸毒人群中HCV感染者體內HCV準種呈多樣性分布的特點。3.通過對1例新近HCV感染者的溯源調查,排除了其共用針具的3個HCV感染者與他之間的潛在傳播關系,并找到了新的傳播線索。4.通過對2個美沙酮門診的HCV感染者進行溯源分析,結果提示同一門診內部分感染者之間、以及2個門診部分感染者之間存在直接或間接的傳播關系。5.鑒于HCV可能存在多重感染的特點,在HCV傳播關系的調查中樣品間基因離散率的最小值這一指標比樣品間平均基因離散率更有價值。6.Hiseq測序具有高通量、操作較簡便、成本相對低的特點,在HCV感染溯源調查中具有較高的實用價值。
【關鍵詞】：丙型肝炎病毒 分子流行病學 高通量測序 準種
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R512.63
【目錄】：

• 摘要6-11
• ABSTRACT11-18
• 前言18-21
• 1 研究對象21-27
• 2 主要儀器設備、試劑及耗材27-28
• 3 實驗方法28-46
• 4 結果46-60
• 5 討論60-63
• 6 結論63-64
• 參考文獻64-69
• 附錄1 已發(fā)表論文69-74
• 附錄2 綜述74-83
• 參考文獻79-83
• 致謝83-84
• 個人簡介84-85

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前8條

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本文編號：592522