本文關(guān)鍵詞：高通量測(cè)序技術(shù)用于丙型肝炎病毒感染溯源調(diào)查

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【摘要】：背景近年來我國的丙型肝炎聚集性疫情暴發(fā)事件時(shí)有發(fā)生。為了調(diào)查疫情暴發(fā)的源頭、追蹤傳播關(guān)系,有針對(duì)性地制定預(yù)防控制方案,需要可靠的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)感染溯源實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)數(shù)據(jù)提供支持。國外報(bào)道用于HCV感染溯源調(diào)查的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)主要有巢式PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法、PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序法和終點(diǎn)有限稀釋PCR產(chǎn)物測(cè)序法,其中巢式PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法國內(nèi)也有報(bào)道。巢式PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法操作簡(jiǎn)便,但獲得的信息量少,只能獲得優(yōu)勢(shì)準(zhǔn)種的核酸序列；而后兩種方法可用于在準(zhǔn)種水平上分析HCV感染者之間的傳播關(guān)系,不足之處是操作比較繁瑣、工作量大。第二代測(cè)序技術(shù)(Next-generation sequencing technology. NGS)的核心思想是邊合成邊測(cè)序(Sequencing by Synthesis),即通過識(shí)別新合成的序列末端的標(biāo)識(shí)來確定DNA的序列,一次檢測(cè)可以獲得大量的核酸信息。目前應(yīng)用較多的技術(shù)平臺(tái)主要包括Illumina/Solexa Genome Analyzer(美國Illumina公司)、Applied Biosystems SOLID system (美國ABI公司)和Roche 454 FLX焦磷酸測(cè)序平臺(tái)(美國454 Life Sciences公司)。其中Roche 454 FLX焦磷酸測(cè)序平臺(tái)曾被用于未經(jīng)過HCV抗病毒治療的感染者病毒準(zhǔn)種的變異性、HCV抗病毒治療患者準(zhǔn)種的變異性、HCV急性感染者病毒進(jìn)化的瓶頸效應(yīng)、HCV暴發(fā)調(diào)查等的研究中,但它因測(cè)序成本很高,用于HCV感染溯源調(diào)查的實(shí)用價(jià)值不大。本課題組曾將美國Illumina公司的Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)成功地用于腎透析人群HCV的傳播關(guān)系調(diào)查。本研究擬利用美國Illumina公司開發(fā)、通量更高的Hiseq高通量測(cè)序平臺(tái)(簡(jiǎn)稱Hiseq測(cè)序),建立基于準(zhǔn)種分析的HCV感染溯源技術(shù),并嘗試用于靜脈注射吸毒人群中HCV的傳播關(guān)系調(diào)查,為今后應(yīng)對(duì)丙型肝炎聚集性疫情暴發(fā)調(diào)查提供技術(shù)儲(chǔ)備。目的1.建立并優(yōu)化基于HCV準(zhǔn)種分析的Hiseq測(cè)序技術(shù)；2.了解靜脈注射吸毒人群中HCV感染者體內(nèi)HCV準(zhǔn)種的分布規(guī)律；3.探索Hiseq測(cè)序技術(shù)在HCV感染溯源調(diào)查中的應(yīng)用。材料和方法1.研究對(duì)象1.1一例新近HCV感染者的溯源調(diào)查針對(duì)1例2015年1月15日在美沙酮門診發(fā)現(xiàn)的HCV抗體陽轉(zhuǎn)靜脈注射吸毒者(編號(hào)P1),調(diào)查在其可能感染HCV的時(shí)期內(nèi)(2014年3月24日之后)與其共用針具、HCV抗體陽性的4例靜脈注射吸毒者(編號(hào)P2-P5)的流行病學(xué)信息,并以與P1在同一美沙酮門診服藥或者居住在同一鄉(xiāng)鎮(zhèn)、HCV抗體陽性的28例靜脈注射吸毒者(編號(hào)C1-C28)作為研究對(duì)照。分別采集上述33人的全血樣品5 m1,離心后分離出血漿備用。1.2兩個(gè)美沙酮門診靜脈注射吸毒HCV感染者間的傳播關(guān)系研究針對(duì)2個(gè)美沙酮門診H和L,收集2015年1-9月發(fā)現(xiàn)的所有靜脈注射吸毒HCV抗體陽性者的血漿樣品備用(編號(hào)分別為H1-H13、L1～L32)。2.實(shí)驗(yàn)方法2.1從血漿樣品中提取RNA,然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。2.2 PCR產(chǎn)物直接測(cè)序：分別對(duì)NS5B基因區(qū)和Core/E1基因區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物直接測(cè)序；根據(jù)序列結(jié)果對(duì)HCV樣品進(jìn)行基因亞型分析。2.3針對(duì)HCV HVR1區(qū)設(shè)計(jì)引物、優(yōu)化反應(yīng)條件。引物盡可能覆蓋多種基因亞型,必要時(shí)設(shè)計(jì)多套引物。2.4針對(duì)HCV HVR1區(qū),對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物純化后,構(gòu)建DNA文庫,然后進(jìn)行Hiseq測(cè)序。2.5 Hiseq測(cè)序數(shù)據(jù)初步處理后,統(tǒng)計(jì)每條獨(dú)特序列出現(xiàn)的頻數(shù),了解HCV準(zhǔn)種群分布情況；剔除重復(fù)序列后,獲得每個(gè)樣品的多個(gè)獨(dú)特準(zhǔn)種群序列,進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果1.一例新近HCV感染者的溯源調(diào)查1.1 HCV基因亞型：P1-P5與28份對(duì)照樣品中有11份樣品(P3和10份對(duì)照)HCV核酸檢測(cè)為陰性,其余樣品核酸檢測(cè)為陽性,并獲得了HCV基因亞型分析結(jié)果。P1和P2均為3b基因亞型,P4、P5分別為3a、6n基因亞型,據(jù)此可以排除P4、P5與P1之間存在傳播關(guān)系的可能性。在18份核酸陽性樣品中,8份(C7、C12、C14、C15、C16、C19、C20、C28)的基因亞型與P1相同。1.2 HCV準(zhǔn)種群分布：在基因亞型為3b的10份樣品中,9份(P1、P2、C7、 C12、C14、C15、C16、C19、C28) PCR擴(kuò)增成功并進(jìn)行Hiseq測(cè)序。Hiseq測(cè)序結(jié)果經(jīng)初步處理后,9份樣品分別得到了約百萬條核酸序列,獲得的有效序列數(shù)為249 753～1086 333條(平均869 608條)。剔除重復(fù)序列后,獲得了3-172個(gè)(平均48個(gè))獨(dú)特準(zhǔn)種群的序列。統(tǒng)計(jì)每份樣品中各準(zhǔn)種群序列出現(xiàn)的頻率并由高到低依次排序,頻數(shù)最大(最優(yōu)勢(shì))的前2條序列的頻數(shù)之和占該樣品所有準(zhǔn)種群總序列的比例都超過了38%,其中4份樣品(C7、C15、C19、C28)超過了85%,有3份樣品(C7、C19、C28)甚至超過了97%。1.3基因離散率：9份樣品的樣品內(nèi)平均基因離散率為0.5%-13.2%,其中P1、C7、C16的均大于6%,樣品內(nèi)平均基因離散率的大小與HCV感染時(shí)間長(zhǎng)短沒有相關(guān)性。9份樣品的樣品間平均基因離散率為10.8%～25.0%,P1和P2間平均基因離散率為19.0%,與P1和其余7份樣品間的基因離散率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.4系統(tǒng)進(jìn)化樹分析：從HCV序列數(shù)據(jù)庫下載25條HCV 3b亞型參考株序列,與9份樣品的準(zhǔn)種群序列一起進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。結(jié)果顯示,P2、C12、C14、C15、C16、C19、C28的準(zhǔn)種群各自聚集為一簇；C7的部分準(zhǔn)種群和P1聚集為一簇,其余準(zhǔn)種群?jiǎn)为?dú)聚集為一簇。和P1聚集在一簇的那部分C7準(zhǔn)種群和P1間的平均基因離散率為6.4%(0～13.3%),這與P1和其余7份樣品間基因離散率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果提示P1和C7間可能存在直接或間接的HCV傳播關(guān)系。鑒于HCV可能存在多重感染的特點(diǎn),在HCV傳播關(guān)系的調(diào)查中樣品間基因離散率的最小值這一指標(biāo)比樣品間平均基因離散率更有價(jià)值。2.兩個(gè)美沙酮門診靜脈注射吸毒HCV感染者間的傳播關(guān)系研究2.1 HCV基因亞型：美沙酮門診H和L共有13份樣品HCV核酸檢測(cè)為陰性,其余樣品核酸檢測(cè)為陽性,并獲得了HCV基因亞型分析結(jié)果。美沙酮門診H有2份樣品(H8、H12) HCV核酸檢測(cè)為陰性；在11份核酸陽性樣品中,1份(H1 1)為3a/3b基因亞型；7份H1、H3、H4、H7、H9、H10、H13)為3b基因亞型,2份(H5、H6)為6a基因亞型,1份(H2)為6u基因亞型。美沙酮門診L有11份樣品(L3、L5、L6、L7、L11、L15、L17、L20、L25、L29、 L32) HCV核酸檢測(cè)為陰性；在21份核酸陽性樣品中,5份(L8、L18、L21、 L28、L31)為1a基因亞型；1份(L14)為3a/3b基因亞型；6份(L1、L10、L12、L13、L16、L24)為3b基因亞型；1份(L19)為6m/6n基因亞型；4份(L4、L22、L23、L30)為6n基因亞型；其余4份L9、L26、L27)分別為6a、1b、6u、3a基因亞型。1b基因亞型只有1份樣品,可以排除該HCV感染者與其他感染者間存在傳播關(guān)系的可能性。2.2 HCV準(zhǔn)種群分布：對(duì)上述基因亞型分析成功且同一基因亞型不少于2份的所有樣品(共31份)進(jìn)行HVR1區(qū)PCR擴(kuò)增,結(jié)果有27份樣品擴(kuò)增成功并進(jìn)行Hiseq測(cè)序。Hiseq測(cè)序結(jié)果經(jīng)初步處理后,27份樣品分別獲得的有效序列數(shù)為366980～2732511條(平均1432153條)。剔除重復(fù)序列后,分別獲得2-207個(gè)(平均45個(gè))獨(dú)特準(zhǔn)種群的序列。統(tǒng)計(jì)每份樣品中各準(zhǔn)種群序列出現(xiàn)的頻率并由高到低依次排序,頻數(shù)最大(最優(yōu)勢(shì))的前2條序列占所有準(zhǔn)種群總序列的比例均超過了16%,其中12份樣品(H1、H3、H4、H6、H9、H11、H13、 L1、L8、L16、L18、L31)超過了82%,甚至有8份樣品(H3、H4、H6、H9, L1、L16、L18、L31)超過了96%。2.3基因離散率：27份樣品的樣品內(nèi)平均基因離散率為0.4%～26.0%,其中H2、H6、H9、L14、L19、L23、L28、L30的均大于5%。大部分樣品之間的最小基因離散率均大于5%,部分樣品之間的基因離散率最小值為0,樣品H6和H9之間的基因離散率最小值為0.4%,H11和L23、L30之間的基因離散率最小值均為0.4%,L8和L21之間的樣品基因離散率最小值為1.9%,L21和L28之間的基因離散率最小值為4.8%。2.4系統(tǒng)進(jìn)化分析：樣品L28、L31的準(zhǔn)種群序列各自單獨(dú)聚集為一簇,樣品L8、L18、L21的所有準(zhǔn)種群序列和L23、L30的部分準(zhǔn)種群序列聚集為一簇；L8和L21之間的基因離散率最小值為1.9%,樣品L8和L23、L18和L23、L18和L30、L21和L23、L21和L30之間的平均基因離散率最小值均為0。樣品H6的部分準(zhǔn)種群序列和H9的準(zhǔn)種群序列聚集在一起,H6和H9之間的基因離散率最小值為0.4%。樣品H3、L10、L12、L14的準(zhǔn)種群序列各自聚集為一簇,樣品H1、H4、H9、H10、H11、H13、L1分別和L23、L30的部分準(zhǔn)種群序列聚集在一起,L24和L23的部分準(zhǔn)種群序列聚在一起,H11和L23、L30之間的平均基因離散率最小值均為0.4%,L24和L23之間的平均基因離散率最小值為0,其余樣品和L23、L30之間的平均基因離散率最小值均為0,系統(tǒng)進(jìn)化樹與基因離散率的結(jié)果共同提示同一門診內(nèi)部分感染者之間以及2個(gè)門診部分感染者之間均可能存在直接或間接的HCV傳播關(guān)系。結(jié)論1.本研究建立了基于HCV準(zhǔn)種分析的Hiseq測(cè)序技術(shù)。2.靜脈注射吸毒人群中HCV感染者體內(nèi)HCV準(zhǔn)種呈多樣性分布的特點(diǎn)。3.通過對(duì)1例新近HCV感染者的溯源調(diào)查,排除了其共用針具的3個(gè)HCV感染者與他之間的潛在傳播關(guān)系,并找到了新的傳播線索。4.通過對(duì)2個(gè)美沙酮門診的HCV感染者進(jìn)行溯源分析,結(jié)果提示同一門診內(nèi)部分感染者之間、以及2個(gè)門診部分感染者之間存在直接或間接的傳播關(guān)系。5.鑒于HCV可能存在多重感染的特點(diǎn),在HCV傳播關(guān)系的調(diào)查中樣品間基因離散率的最小值這一指標(biāo)比樣品間平均基因離散率更有價(jià)值。6.Hiseq測(cè)序具有高通量、操作較簡(jiǎn)便、成本相對(duì)低的特點(diǎn),在HCV感染溯源調(diào)查中具有較高的實(shí)用價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：丙型肝炎病毒 分子流行病學(xué) 高通量測(cè)序 準(zhǔn)種
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.63
【目錄】：

• 摘要6-11
• ABSTRACT11-18
• 前言18-21
• 1 研究對(duì)象21-27
• 2 主要儀器設(shè)備、試劑及耗材27-28
• 3 實(shí)驗(yàn)方法28-46
• 4 結(jié)果46-60
• 5 討論60-63
• 6 結(jié)論63-64
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 附錄1 已發(fā)表論文69-74
• 附錄2 綜述74-83
• 參考文獻(xiàn)79-83
• 致謝83-84
• 個(gè)人簡(jiǎn)介84-85

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：592522