本文關(guān)鍵詞：HBV前S2蛋白對(duì)信號(hào)分子LPA的影響及LPA對(duì)胰島素分泌的作用

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【摘要】：目的研究HBV pre-S2的表達(dá)與細(xì)胞核內(nèi)定位,pre-S2對(duì)水解性溶血磷脂酸(LPA)的溶血磷脂酶A1(LYPLA-1)啟動(dòng)子的反式激活作用,以及外源性LPA對(duì)胰島素分泌的影響,為進(jìn)一步研究乙型肝炎并發(fā)糖尿病的發(fā)病機(jī)制提供研究線索與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1.HBV pre-S2的表達(dá)與細(xì)胞核內(nèi)定位(1)HBV pre-S2和綠色熒光蛋白融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建:從乙肝患者血清中提取HBV DNA,設(shè)計(jì)帶HindⅢ、EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增HBV pre-S2基因,膠回收后克隆入T-easy載體構(gòu)建pGEM-HBV-S2。HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切pGEM-HBV-S2和pcDNA3.1-EGFP,分別膠回收pre-S2基因片段及酶切后的pcDNA3.1(+)-EGFP質(zhì)粒,連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α以獲得pcDNA3.1-PreS2-EGFP。(2)pre-S2在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá):pcDNA3.1-PreS2-EGFP轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞48h后,經(jīng)4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色細(xì)胞核,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。2.pre-S2對(duì)LYPLA-1啟動(dòng)子的反式激活作用應(yīng)用LYPLA-1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-LYPLA-1和pre-S2真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-pre-S2共轉(zhuǎn)染HepG2,然后通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性來(lái)評(píng)價(jià)pre-S2對(duì)LYPLA-1基因啟動(dòng)子的作用。3.外源性LPA對(duì)胰島素分泌的影響(1)小鼠胰島細(xì)胞的分離純化:首先通過(guò)膽總管逆行灌注膠原酶Ⅴ溶液進(jìn)行小鼠胰腺消化,分離胰島,然后采用不連續(xù)密度梯度Ficoll離心法純化胰島細(xì)胞。(2)外源性LPA對(duì)胰島細(xì)胞胰島素分泌的影響:以0μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L和5μmol/L濃度LPA刺激原代培養(yǎng)的胰島細(xì)胞和分泌胰島素細(xì)胞MIN6,以培養(yǎng)液總蛋白濃度校正胰島素分泌量測(cè)定胰島素濃度。結(jié)果重組載體pcDNA3.1-PreS2-EGFP測(cè)序結(jié)果證實(shí)其包含HBV pre-S2基因序列,經(jīng)亞克隆后酶切及測(cè)序均證實(shí)構(gòu)建的重組載體與設(shè)計(jì)一致。熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示,pEGFP-preS2轉(zhuǎn)染后可介導(dǎo)pre-S2-EGFP融合蛋白表達(dá)且綠色熒光明顯集中在細(xì)胞核內(nèi)。HBV pre-S2激活LYPLA-1基因啟動(dòng)子。外援性LPA在0-3μmol/L濃度范圍內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞的胰島素分泌。結(jié)論HBV pre-S2可定位于細(xì)胞核并激活能水解LPA的LYPLA-1基因啟動(dòng)子,外源性LPA影響胰島細(xì)胞和MIN6細(xì)胞的胰島素分泌,在0-3μmol/L濃度范圍內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞的胰島素分泌。
【關(guān)鍵詞】：HBV前S2蛋白 溶血磷脂酸 胰島素分泌
【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R587.1;R512.62
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 英漢縮略詞表9-11
• 前言11-13
• 1 材料與方法13-19
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器13-15
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法15-19
• 2 結(jié)果19-25
• 2.1 HBV前S2蛋白綠色熒光蛋白融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建19-21
• 2.2 HBV前S2蛋白核定位研究21-22
• 2.3 HBV前S2蛋白的反式激活溶血磷脂酶A1啟動(dòng)子的研究22-23
• 2.4 小鼠胰島細(xì)胞的分離23-24
• 2.5 外源性溶血磷脂酸對(duì)葡萄糖誘導(dǎo)胰島素分泌的影響24-25
• 3 討論25-27
• 4 結(jié)論27-28
• 參考文獻(xiàn)28-32
• 綜述32-42
• 參考文獻(xiàn)38-42
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄42-43
• 致謝43-44

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