目的：建立一種穩(wěn)定而確實可靠的肝卵圓細胞分離方法,為后續(xù)的實驗研究奠定基礎(chǔ)。 方法：參照Bryon等的報道,利用攜帶GFP(綠色熒光蛋白)轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠12只,2只作為空白對照,10只喂以含濃度為0.1%的3,5-二乙酯基-1,4二氫三甲基毗啶(DDC),刺激卵圓細胞的增生。而后利用兩步酶灌注法分離出肝非實質(zhì)細胞,以Sca-1抗體標記的免疫磁珠分選方法加以純化分離出攜帶有GFP的SCa-1+細胞。 結(jié)果：DDC喂養(yǎng)小鼠6周后,病理切片結(jié)果顯示肝組織內(nèi)可見明顯的肝卵圓細胞增生反應(yīng)。分離每只小鼠得可到約106/ml的非肝實質(zhì)細胞,培養(yǎng)擴增約5d后可見克隆樣生長的卵圓細胞,通過Sca-1抗體標記的免疫磁珠分選提純。電鏡下細胞直徑10-15μm,呈鋪路石樣排列,多角形,折光性強,核大,卵圓形,胞漿少,核仁明顯。經(jīng)過鑒定,分離得到的Sca-1+細胞符合卵園細胞的形態(tài)學(xué)表現(xiàn),也表達膽管上皮的表面標記OV-6及肝細胞的表面標記AFP,分離純度達95%以上。 結(jié)論：該方法穩(wěn)定可靠,可為肝卵圓細胞的相關(guān)研究提供較為理想的研究手段。 目的：研究肝卵圓細胞在治療小鼠肝纖維化疾病中的有效性。 方法：...

【文章頁數(shù)】：129 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
目錄
符號說明
前言
第一部分 肝卵圓細胞的分離與體外擴增
    1 材料與方法
        1.1 主要的試劑及藥品
        1.2 主要試劑的配制
        1.3 主要的儀器及設(shè)備
        1.4 動物的選擇及喂養(yǎng)
        1.5 肝臟標本的采集
        1.6 卵圓細胞的分離培養(yǎng)
        1.7 卵圓細胞的純化
        1.8 卵圓細胞的鑒定
            1.8.1 組織切片
                1.8.1.1 常規(guī)石蠟切片的制作
                1.8.1.2 蘇木精—伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色
                1.8.1.3 免疫組化染色
            1.8.2 純化卵圓細胞的進一步鑒定
    2 結(jié)果
    3 討論
    4 結(jié)論
第二部分 卵圓細胞經(jīng)脾臟移植治療小鼠肝纖維化的實驗研究
    1 材料與方法
        1.1 主要的試劑及藥品
        1.2 主要試劑的配制
        1.3 主要的儀器及設(shè)備
        1.4 動物的選擇及喂養(yǎng)
        1.5 肝纖維化模型的建立
        1.6 麻醉及移植方法的建立
        1.7 卵圓細胞治療實驗性肝纖維化的研究
            1.7.1 動物的分組及處理
            1.7.2 標本的采集
            1.7.3 療效的評價
                1.7.3.1 分別進行以下指標的檢測
                1.7.3.2 肝功能指標
                1.7.3.3 肝臟羥脯氨酸(Hyp)含量測定
                1.7.3.4 肝臟膠原纖維含量
                1.7.3.5 肝纖維化病理學(xué)分級
                1.7.3.6 移植后卵圓細胞在肝臟內(nèi)的定居
            1.7.4 數(shù)據(jù)處理
    2 結(jié)果
        2.1 小鼠的一般情況變化
        2.2 肝纖維化的建模情況
        2.3 卵圓細胞的分布情況
        2.4 小鼠肝功能指標的變化
        2.5 肝臟羥脯氨酸和膠原纖維含量的變化
        2.6 病理組織學(xué)的分級變化情況
    3 討論
    4 結(jié)論
第三部分 卵圓細胞與骨髓間質(zhì)干細胞經(jīng)脾移植治療實驗性小鼠肝纖維化的療效比較
    1 材料與方法
        1.1 主要的試劑及藥品
        1.2 主要試劑的配制
        1.3 主要的儀器及設(shè)備
        1.4 動物的選擇及喂養(yǎng)
        1.5 肝纖維化模型的建立
        1.6 骨髓間充質(zhì)干細胞的分離與培養(yǎng)
            1.6.1 骨髓細胞的采集
            1.6.2 密度梯度離心法分離MSC及培養(yǎng)
        1.7 MSC的鑒定
            1.7.1 小鼠MSC表面標記的測定
            1.7.2 體外誘導(dǎo)成骨細胞鑒定
        1.8 麻醉及移植方法的建立
        1.9 HOC與MSC移植治療實驗性肝纖維化的療效比較
            1.9.1 動物的分組及處理
            1.9.2 標本的采集及療效的評價
                1.9.2.1 標本的采集
                1.9.2.2 療效的評價
                    1.9.2.2.1 分別進行以下指標的檢測
                    1.9.2.2.2 肝功能指標
                    1.9.2.2.3 肝臟羥脯氨酸(Hyp)含量測定
                    1.9.2.2.4 肝臟膠原纖維含量
                    1.9.2.2.5 肝纖維化病理學(xué)分級
            1.9.3 數(shù)據(jù)處理
    2 結(jié)果
        2.1 MSC的鑒定結(jié)果
            2.1.1 MSCs的形態(tài)學(xué)觀察
            2.1.2 MSCs的鑒定
        2.2 小鼠的一般情況變化
        2.3 小鼠肝功能指標的變化
        2.4 肝臟羥脯氨酸和膠原纖維含量的變化
        2.5 病理組織學(xué)的分級變化情況
    3 討論
    4 結(jié)論
參考文獻
綜述一 干細胞研究進展
綜述二 肝卵圓干細胞研究進展
攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及科研課題
致謝



本文編號：3809269