戊型肝炎病毒(HEV)不穩(wěn)定易降解,難以從載毒標(biāo)本中分離,而迄今為止仍沒有有效的細(xì)胞培養(yǎng)模型,這很大程度上限制了HEV感染致病機(jī)制的研究。近年來,隨著對(duì)HEV研究的深入,較好模擬了HEV病毒衣殼表面結(jié)構(gòu)的重組蛋白為研究HEV與宿主細(xì)胞相互作用提供了一條新的途徑。 HEV衣殼由單一蛋白(pORF2)組成,大量研究表明pORF2的重組表達(dá)片段p239(aa368—606)很好地模擬了HEV的免疫優(yōu)勢(shì)中和表位。p239對(duì)HEV與原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞的吸附阻斷,p239對(duì)多株細(xì)胞系具有與HEV相似的嗜性,以及多株HEV特異單抗對(duì)p239與HepG2細(xì)胞結(jié)合的特異阻斷,強(qiáng)有力地提示p239同時(shí)也很好地模擬了HEV與細(xì)胞膜的結(jié)合所具備的表面結(jié)構(gòu)特征。因此,p239與HepG2細(xì)胞的吸附模型是探討HEV與細(xì)胞膜相瓦作用的可靠工具。 不同結(jié)合區(qū)域的HEV單抗及其Fab片段對(duì)p239吸附細(xì)胞的阻斷結(jié)果提示,p239表面至少存在兩個(gè)細(xì)胞受體結(jié)合區(qū)域:其一為HEV的主要免疫優(yōu)勢(shì)中和表位(ORF2 aa459-606),另一個(gè)區(qū)域?yàn)閍a423-438。這兩個(gè)區(qū)域均對(duì)p239與細(xì)胞的特異性吸附有貢獻(xiàn),均能...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要(Abstract)
縮略詞
前言
    1.病毒入侵過程中與宿主細(xì)胞之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)
        1.1.病毒穿膜
        1.2.病毒基因的靶向轉(zhuǎn)運(yùn)
        1.3.病毒誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)
    2.用于研究病毒與宿主蛋白相互作用的方法
        2.1.生物物理學(xué)方法
        2.2.分子生物學(xué)方法
        2.3.生物信息學(xué)方法
    3.戊型肝炎病毒
        3.1.戊型肝炎病毒的流行
        3.2.HEV的生物學(xué)特征
        3.3.HEV的細(xì)胞培養(yǎng)模型研究進(jìn)展
        3.4.HEV衣殼蛋白ORF2上中和表位的研究進(jìn)展
    4.本論文研究的目的與意義
材料與方法
    1.材料
        1.1.主要儀器
        1.2.主要試劑與材料
        1.3.試劑
        1.4.培養(yǎng)基及常用溶液配制
    2.方法
        2.1.基因克隆
        2.2.重組蛋白的表達(dá)與純化
        2.3.蛋白質(zhì)的透析復(fù)性
        2.4.重組蛋白的性質(zhì)分析方法
        2.5.常規(guī)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法
        2.6.蛋白與細(xì)胞的吸附檢測(cè)法
        2.7.酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)方法
        2.8.親合層析操作方法
        2.9.二維電泳操作步驟
        2.10.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)
        2.11.HepG2細(xì)胞中蛋白基因的調(diào)取
        2.12.免疫共沉淀
        2.13.計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)與分析
第一部分 戊型肝炎病毒細(xì)胞吸附模型的建立及病毒吸附區(qū)域初步研究
    結(jié)果與分析
        1.戊型肝炎病毒細(xì)胞吸附模型的建立
            1.1.p239阻斷HEV對(duì)嗜性細(xì)胞的感染
            1.2.p239對(duì)多株細(xì)胞系的特異性吸附
            1.3.p239對(duì)HepG2細(xì)胞吸附的特異性
        2.病毒與受體結(jié)合區(qū)域的初步確定
            2.1.單抗表位的空間位置關(guān)系
            2.2.多株單抗對(duì)p239吸附HepG2細(xì)胞的阻斷
            2.3.單抗的Fab段對(duì)p239吸附HepG2細(xì)胞的阻斷
            2.4.線性單抗決定族的定位
            2.5.E2重組蛋白多肽對(duì)HepG2細(xì)胞的吸附
            2.6.p239蛋白結(jié)合位點(diǎn)缺失突變體的構(gòu)建與鑒定
            2.7.p239及其結(jié)合位點(diǎn)突變體△239、233N與HepG2細(xì)胞的吸附性
            2.8.p239及其結(jié)合位點(diǎn)突變體△239、233N對(duì)HEV吸附HepG2細(xì)胞的影響
    討論
        1.p239顆粒-HepG2細(xì)胞吸附模型
            1.1.p239具有HEV免疫優(yōu)勢(shì)表位
            1.2.p239具有HEV與嗜性細(xì)胞結(jié)合的關(guān)鍵表位
        2.HEV與宿主細(xì)胞的相互作用區(qū)域
        3.HEV細(xì)胞吸附模型的推測(cè)
第二部分 HEV嗜性組織中與HEV衣殼蛋白相互作用蛋白的初步研究
    結(jié)果與分析
        1.酵母雙雜交篩選人肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)中與HEV衣殼蛋白相互作用蛋白
            1.1.構(gòu)建表達(dá)載體BD-E2和AD-E2及酵母表達(dá)BD-E2和AD-E2的活性鑒定
            1.2.E2的表達(dá)對(duì)酵母細(xì)胞影響的檢測(cè)
            1.3.E2相互作用蛋白的篩選
            1.4.生物信息學(xué)分析
            1.5.陽(yáng)性克隆的體外驗(yàn)證
        2.HepG2細(xì)胞中與戊型肝炎病毒衣殼蛋白相互作用蛋白的初步研究
            2.1.誘餌蛋白p239-CBP表達(dá)后中和表位及顆粒性的鑒定
            2.2.HepG2細(xì)胞中與p239-CBP相互作用蛋白的獲取
            2.3.猴肝組織中與p239-CBP相互作用蛋白的獲取
            2.4.目的蛋白的MALDI-TOF-MS分析
            2.5.生物信息學(xué)分析
        3.GRP78/Bip與p239相互作用的進(jìn)一步驗(yàn)證
            3.1.GRP78/Bip基因的獲得及GRP78/Bip的真核表達(dá)
            3.2.HEV類病毒顆粒p239與GRP78/Bip體外免疫共沉淀
            3.3.p239與重組Grp78/Bip可直接相互作用
            3.4.GRP78/Bip與p239在細(xì)胞內(nèi)的共定位
        4.HSP90與p239相互作用的驗(yàn)證
            4.1.免疫共沉淀驗(yàn)證HSP90與p239的相互作用
            4.2.HSP90與p239的細(xì)胞共定位
    討論
        1.酵母雙雜交方法篩選相互作用蛋白
            1.1.酵母雙雜交系統(tǒng)中誘餌蛋白的選擇
            1.2.控制酵母雙雜交系統(tǒng)高效性,穩(wěn)定性的一些關(guān)鍵因素
            1.3.對(duì)酵母雙雜交系統(tǒng)中的陽(yáng)性與假陽(yáng)性的認(rèn)識(shí)
        2.親和層析篩選結(jié)合蛋白
        3.2-DE和MALDI-TOF MS分離鑒定蛋白
        4.蛋白相互作用的進(jìn)一步驗(yàn)證
        5.肝炎病毒與有絲分裂原激活的蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)途徑(MAPK)
        6.熱休克蛋白
            6.1.熱休克蛋白70(HSP70)
            6.2.熱休克蛋白90(HSP90)
論文小結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3803894