發(fā)布時間：2022-12-11 14:44

　　壞死性腸炎（Necrotic Enteritis,NE）是由產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）引起的一類非常重要的肉雞疾病,發(fā)病率可達(dá)30%以上,病死率為18%～31%,目前尚未研制出有效的防制疫苗。研究發(fā)現(xiàn)某些由強(qiáng)毒產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株產(chǎn)生的特有分泌蛋白具有一定的免疫原性,肌內(nèi)注射或者口服免疫這些免疫原蛋白對強(qiáng)毒產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒引起的試驗性NE有免疫保護(hù)作用。因此,本研究目的就是通過分離和鑒定免疫原性分泌蛋白,評價其對NE的重要性及免疫原性;評價構(gòu)建的攜帶產(chǎn)氣莢膜梭菌免疫原性分泌蛋白基因的減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗的免疫效果,從而為NE的減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗研制提供一定的依據(jù)。 （1）通過運(yùn)用SDS-PAGE蛋白電泳方法分離強(qiáng)毒株和弱毒株的分泌蛋白,然后與陽性NE免疫雞血清進(jìn)行Western blot反應(yīng),將強(qiáng)毒株特有的3條有較強(qiáng)免疫反應(yīng)蛋白條帶切割,進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定。分離鑒定了3種強(qiáng)毒產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株所特有的分泌蛋白,分別是toxin C.perfringens large cytotoxin（TpeL）, Endo-beta-N-acety... 

【文章頁數(shù)】：120 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
文獻(xiàn)綜述
    第一章 產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的雞壞死性腸炎研究進(jìn)展
        1.1 人類和動物的梭菌感染
            1.1.1 與毒力有關(guān)的產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒素和酶
            1.1.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌的全基因組序列
            1.1.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌的VirR/VirS 調(diào)節(jié)系統(tǒng)
        1.2 雞壞死性腸炎
            1.2.1 NE 株的分子分型
            1.2.2 NE 的誘因
            1.2.3 NE 的發(fā)病機(jī)制
            1.2.4 NE 的防制
        1.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的免疫保護(hù)
            1.3.1 α-毒素在產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的免疫保護(hù)力的作用
        1.4 活的口服減毒沙門氏菌重組載體疫苗
            1.4.1 沙門氏菌載體
            1.4.2 質(zhì)粒載體
            1.4.3 異源性抗原表達(dá)及其免疫原性
            1.4.4 細(xì)胞抗原表達(dá)的位置
        1.5 論文設(shè)計思路及研究方法
試驗研究
    第二章 A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌幾種分泌蛋白的分離鑒定
        2.1 材料
            2.1.1 菌株及血清抗體
            2.1.2 主要試劑及試劑盒
            2.1.3 培養(yǎng)基
            2.1.4 SDS-PAGE 及Western blot 緩沖液的配制
            2.1.5 儀器設(shè)備
        2.2 方法
            2.2.1 分泌蛋白的沉淀及濃縮
            2.2.2 SDS-PAGE 電泳
            2.2.3 Western blot
            2.2.4 蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析
        2.3 結(jié)果
            2.3.1 A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素粗提
            2.3.2 CP4 外毒素的SDS-PAGE 和Western blot 的分析結(jié)果
            2.3.3 三種分泌蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果
        2.4 討論
        2.5 小結(jié)
    第三章 重組蛋白的表達(dá)純化及對肉雞NE 的免疫保護(hù)效果
        3.1 材料
            3.1.1 菌種、質(zhì)粒和載體
            3.1.2 主要試劑及試劑盒
            3.1.3 儀器設(shè)備
            3.1.4 培養(yǎng)基
            3.1.5 緩沖液
            3.1.6 實驗動物
        3.2 方法
            3.2.1 基因克隆
            3.2.2 重組蛋白的過量表達(dá)
            3.2.3 重組蛋白的分離純化
            3.2.4 SDS-PAGE 及Western blot 分析
            3.2.5 重組蛋白的免疫試驗
            3.2.6 血清生長抑制試驗
            3.2.7 雞血清抗體滴度的測定
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 目的基因的克隆
            3.3.2 表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建
            3.3.3 重組蛋白的表達(dá)條件優(yōu)化
            3.3.4 6×His-tagged 重組蛋白的純化
            3.3.5 重組蛋白的濃縮
            3.3.6 免疫雞對攻毒誘導(dǎo)的壞死性腸炎的免疫保護(hù)性
            3.3.7 重組抗原誘導(dǎo)免疫雞的抗原特異性的抗體免疫反應(yīng)
            3.3.8 血清細(xì)菌生長抑制試驗結(jié)果
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
    第四章 減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗對NE 的免疫保護(hù)效果
        4.1 材料
            4.1.1 實驗動物
            4.1.2 菌株及質(zhì)粒
            4.1.3 試劑及培養(yǎng)基
            4.1.4 各種溶液的配制
        4.2 方法
            4.2.1 疫苗株的準(zhǔn)備
            4.2.2 動物飼養(yǎng)管理
            4.2.3 疫苗免疫試驗
            4.2.4 病理剖檢
            4.2.5 抗體滴度的ELISA 測定
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 免疫雞對試驗誘導(dǎo)的NE 的免疫保護(hù)性
            4.3.2 疫苗免疫誘導(dǎo)的抗原特異性抗體免疫反應(yīng)
        4.4 討論
        4.5 小結(jié)
    第五章 減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗對沙門氏菌的免疫保護(hù)效果
        5.1 材料
            5.1.1 實驗動物
            5.1.2 菌株
            5.1.3 藥品試劑
            5.1.4 培養(yǎng)基及溶液的配制
        5.2 方法
            5.2.1 藥敏試驗
            5.2.2 抗萘啶酸沙門氏菌菌株的選育
            5.2.3 實驗動物的飼養(yǎng)管理
            5.2.4 攻毒菌株的準(zhǔn)備
            5.2.5 疫苗株的準(zhǔn)備
            5.2.6 免疫程序和細(xì)菌定殖減少的評價
            5.2.7 樣品采集
            5.2.8 糞便樣品中疫苗株細(xì)菌的計數(shù)
            5.2.9 內(nèi)臟組織中攻毒菌株細(xì)菌的計數(shù)
            5.2.10 糞便樣品中攻毒株細(xì)菌的計數(shù)
        5.3 結(jié)果
            5.3.1 藥敏試驗結(jié)果
            5.3.2 免疫雞糞便樣品中的疫苗株計數(shù)結(jié)果
            5.3.3 疫苗株χ9241-tHP 誘導(dǎo)的攻毒菌株定殖減少結(jié)果
            5.3.4 疫苗株χ9352–tHP 誘導(dǎo)的攻毒菌株定殖減少結(jié)果
        5.4 討論
        5.5 小結(jié)
結(jié)論
本論文的創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
附錄
縮略詞
致謝
作者簡介



本文編號：3718971