眾所周知,乙肝病毒是一種在人類中廣泛存在的病原體。慢性乙肝病毒感染是造成肝癌發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵的因素,但是其分子機(jī)制還不是很清楚。microRNA介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞之間的相互作用過程中發(fā)揮著重要的作用。宿主來源的microRNA對病毒的調(diào)控作用主要存在有兩個(gè)方面：一方面,調(diào)控宿主細(xì)胞內(nèi)的基因靶標(biāo)或病毒的基因來協(xié)助病毒的復(fù)制。另一方面,誘導(dǎo)mRNA降解和抑制翻譯等機(jī)制間接地調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞和病毒自身的靶基因,參與宿主細(xì)胞對病毒侵染的抵御和病毒對宿主的抵抗與逃避。目前有關(guān)microRNA與HBV病毒相互調(diào)控作用的研究也越來越多。宿主microRNA對HBV復(fù)制的調(diào)控主要是通過直接或間接方式來調(diào)控。當(dāng)HBV侵染宿主細(xì)胞之后,HBV可能會改變宿主細(xì)胞內(nèi)miRNA的表達(dá)譜,但是其具體機(jī)制也不是很清楚。目前研究表明HBV侵染細(xì)胞之后,miRNA的表達(dá)譜會發(fā)生一些變化。據(jù)推測可能是HBV侵染之后激活宿主自身的一些特定轉(zhuǎn)錄因子（細(xì)胞因子）,而這些特定轉(zhuǎn)錄因子（細(xì)胞因子）則影響miRNA的轉(zhuǎn)錄或干擾rniRNA的成熟。本論文的主要研究發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)方面：一,發(fā)現(xiàn)miR15a直接靶定在HBV所編碼的HBp和HBx基因... 

【文章來源】：武漢大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：95 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 序言
    1. MicroRNA簡介
        1.1 MicroRNA的定義和基本特征
        1.2 microRNA的發(fā)現(xiàn)
        1.3 microRNA的命名
        1.4 microRNA的生物合成
        1.5 microRNA的作用機(jī)制和生物學(xué)功能
            1.5.1 microRNA調(diào)控基因的作用機(jī)制
            1.5.2 miRNA的正向調(diào)控和可逆的抑制
            1.5.3 P-body,Stress Granules(SG),Multivesicular Bodies和Endosomes在miRNA介導(dǎo)基因表達(dá)沉默中的功能
            1.5.4 microRNA的生物學(xué)功能
    2. 乙肝病毒(HBV)簡介
        2.1 肝病毒(HBV)的定義和基本特征
        2.2 乙肝病毒(HBV)所編碼蛋白的生物學(xué)功能
            2.2.1 表面蛋白(S蛋白)的生物學(xué)功能
            2.2.2 核心蛋白(C蛋白)和e抗原(HBeAg)的生物學(xué)功能
            2.2.3 聚合酶P蛋白的生物學(xué)功能
            2.2.4 X蛋白的生物學(xué)功能
        2.3 HBV相關(guān)疾病以及相關(guān)治療的近況和進(jìn)展
    3. microRNA與病毒之間的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用
        3.1 microRNA對病毒的調(diào)控作用
        3.2 病毒自身編碼的microRNA對其自身復(fù)制以及宿主的調(diào)控作用
            3.2.1 病毒自身編碼的microRNA(vmiRNA)
            3.2.2 病毒編碼的microRNA對病毒自身編碼的基因表達(dá),轉(zhuǎn)錄本RNA以及復(fù)制的調(diào)控作用
            3.2.3 病毒自身編碼的microRNA對宿主mRNA的調(diào)控作用
        3.3 病毒對microRNA的調(diào)節(jié)作用
        3.4 miRNA在相關(guān)肝疾病中作用
        3.5 microRNA與HBV病毒的復(fù)制以及由其感染所引發(fā)的肝癌疾病中等相互調(diào)控作用的研究進(jìn)展
            3.5.1 miRNA調(diào)控乙肝病毒HBV的復(fù)制
            3.5.2 miRNA與肝炎病毒導(dǎo)致的HCC
    4. miR15a/16的生物學(xué)功能
    5. 本課題的研究內(nèi)容及意義
        5.1 本課題的研究內(nèi)容
        5.2 本課題的研究意義
第二章 材料與方法
    1. 材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)所用到的菌株,質(zhì)粒和細(xì)胞系
        1.2 實(shí)驗(yàn)中所用到主要的生化試劑以及來源
        1.3 分子克隆相關(guān)實(shí)驗(yàn)中所用到的酶和試劑盒及來源
        1.4 分子克隆和生化實(shí)驗(yàn)等相關(guān)實(shí)驗(yàn)中所用到溶液及配置
            1.4.1 制備感受態(tài)細(xì)胞以及檢測所用的溶液及配置
            1.4.2 SDS堿裂解法提取質(zhì)粒所用的溶液及配置
            1.4.3 核酸電泳以及蛋白質(zhì)電泳所用到的溶液及配置
        1.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中所用到的試劑來源以及所用的溶液的配置
            1.5.1 試劑
            1.5.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中所用到溶液的配置
        1.6 本實(shí)驗(yàn)中所用到的引物
        1.7 本實(shí)驗(yàn)所用到RNA oligo
        1.8 本實(shí)驗(yàn)中所構(gòu)建的質(zhì)粒
        1.9 本實(shí)驗(yàn)用到的儀器
        1.10 繪圖軟件
        1.11 分析軟件
    2. 方法
        2.1 普通克隆的構(gòu)建方法
        2.2 制備大腸桿菌(E.coli DH5α)感受態(tài)細(xì)胞以及檢測轉(zhuǎn)化效率
            2.2.1 受體菌的活化培養(yǎng)
            2.2.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.2.3 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的檢測
        2.3 SDS堿裂解法質(zhì)粒DNA的制備(分子克隆所用)
        2.4 超純質(zhì)粒的制備(細(xì)胞轉(zhuǎn)染所用)
        2.5 從DMEM培養(yǎng)液中提取HBV病毒顆粒(以24孔板為例)
        2.6 乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原的檢測(酶聯(lián)免疫法)
        2.7 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作
            2.7.1 細(xì)胞的復(fù)蘇
            2.7.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng)
            2.7.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            2.7.4 細(xì)胞凍存
        2.8 RT-PCR
            2.8.1 RNA的提取(以24孔的培養(yǎng)板為例)
            2.8.2 基因組DNA的消解
            2.8.3 RNA的逆轉(zhuǎn)錄
            2.8.4 用制備好的cDNA為模板進(jìn)行PCR
        2.9 熒光定量PCR
            2.9.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備
            2.9.2 樣品及標(biāo)準(zhǔn)樣品的擴(kuò)增
        2.10 Western blot
            2.10.1 蛋白樣品的制備一
            2.10.2 蛋白樣品的制備二(從TRIzol中提取蛋白)
            2.10.3 蛋白含量的測定
            2.10.4 SDS-PAGE電泳
            2.10.5 轉(zhuǎn)膜
            2.10.6 免疫反應(yīng)
            2.10.7 化學(xué)發(fā)光,顯影,定影
            2.10.8 凝膠圖像定量分析
        2.11 雙色熒光的檢測
            2.11.1 細(xì)胞樣品的處理
            2.11.2 熒光素酶活性的測定
第三章 結(jié)果與討論
    1. 結(jié)果
        1.1 microRNA與HBV病毒之間存在重要的相互作用
            1.1.1 miRNApathway參與并影響HBV的復(fù)制
            1.1.2 HBV侵染宿主細(xì)胞之后,miRNA表達(dá)水平的變化
        1.2 miR15a/16抑制HBV增殖
            1.2.1 預(yù)測miR15a在HBV基因組上潛在的靶標(biāo)信息
            1.2.2 miR-15a抑制HBV復(fù)制
        1.3 miR-15a分別靶定在HBx和HBp的CDS區(qū)域
            1.3.1 熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)miR-15a對靶定在HBx和HBp的重疊區(qū)域的調(diào)控
            1.3.2 熒光索酶報(bào)告檢測證實(shí)miR-15a對靶定在HBp區(qū)域的靶標(biāo)位點(diǎn)的調(diào)控
            1.3.3 miR-15a對HBx蛋白的調(diào)節(jié)
        1.4 HBx可以調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)
    2. 討論
第四章 研究工作總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號：3551730